牛 輝,苑克偉,史美龍,陳治龍*

(1.北華大學附屬醫(yī)院普外科,吉林吉林132011;2.吉林省人民醫(yī)院普外科)

血管緊張素轉移酶(Angiotensin I-converting enzyme,ACE),又稱CD143,是腎素血管緊張素系統(tǒng)的關鍵酶,廣泛表達于多種器官和組織。參與腫瘤血管生成、細胞生長、遷移和轉移[1]。ACE蛋白和mRNA在多種腫瘤中均有差異性表達[2]。體內外實驗及流行病學研究均顯示使用ACE抑制劑能夠減緩腫瘤生長和血管生成[3]。由此認為,ACE抑制劑有望成為新的抗腫瘤藥物,用于腫瘤的防治中。然而,ACE mRNA與結直腸癌臨床特征的關系未見文獻報道,本研究采用實時熒光定量PCR檢測ACE mRNA在結直腸癌中的表達,初步探討其與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤轉移的關系以及臨床應用的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

結直腸癌癌組織及癌旁組織各31例,均來自北華大學附屬醫(yī)院手術切除標本,手術切除組織立即液氮凍存,腫瘤組織均經病理檢查證實,為結直腸癌。其中男性15例,女性16例,平均年齡55.6(±13.4)歲。癌旁組織取自距結直腸癌病變邊緣2.0 cm的組織。

1.2 儀器與試劑

TRIpure Reagent購自北京百泰克公司,逆轉錄試劑盒和SYBRGreen II實時熒光定量PCR試劑盒均購自Fermentas公司。參照文獻[2]設計ACE引物[2]:上 游:5′-CTCAAGTACTTCCAGCCAGTC-3′;下游 :5′-GCAGAATCTTGCTGGTCT CTG-3′。內參 GAPDH:上游引物 :5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′;下 游 引 物 :5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′,引物由上海英俊生物有限公司合成。ABI7500熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品。

1.3 總RNA抽提及反轉錄

取液氮凍存組織約60 mg,加入TRIpure 1 ml,勻漿,加入0.2 ml氯仿,離心后吸取上清,加入0.5 ml異丙醇,離心沉淀后棄上清,75%乙醇沉淀,無RNA酶水溶解RNA。取 1 μ l用NANODROP 1000超微量紫外分光光度計進行RNA定量檢測,分裝后-80℃保存?zhèn)溆?。反轉錄操作按照試劑盒(Fermentas公司)操作說明書進行,所得cDNA-20℃保存。

1.4 實時熒光定量PCR

用EASY Dilution 將 cDNA 液按 100、101、102、103和104梯度稀釋后,各取 2 μ l進行實時熒光定量PCR反應,制備標準曲線,檢測目的基因和內參GAPDH的擴增效率。20 μ l反應體系中加入cDNA模版 2.0 μ l,SYBR Premix Ex TaqTM(2 ×)10.0 μ l,上、下游引物(20 pmol/μ l)各 0.3 μ l,Rox Reference Dye II 0.4 μ l,去離子水補足 20 μ l。反應條件:95℃10 s,95℃5 s,60℃34 s,共40個循環(huán)。以GAPDH為內對照,并分別加陰性對照。采用雙標準曲線法進行定量分析。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR擴增產物特異性驗證

熔解曲線驗證引物的特異性(見圖1),結果顯示擴增產物無非特異性條帶和引物二聚體形成,表明引物的特異性較好,可用于實時熒光定量PCR。

圖1 ACE基因實時熒光定量PCR熔解曲線

2.2 實時熒光定量PCR檢測ACE mRNA的表達

ACE mRNA在結直腸癌組織中的表達顯著高于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)(見表1)。結直腸癌組織ACE mRNA的表達與臨床病理特征的關系見表2。ACE mRNA在低分化結直腸癌患者組的表達明顯高于高中分化患者組(P＜0.05);在有轉移患者組的表達明顯高于無轉移患者組(P＜0.05);在臨床Ⅰ-Ⅱ期和ⅢⅣ期患者組的表達無顯著性差異(P＞0.05)。

表1 結直腸癌組織及癌旁組織ACE mRNA的表達情況

表2 ACE mRNA的表達與結直腸癌臨床病理特征的相關性

3 討論

血管緊張素轉移酶(Angiotensin I-converting enzyme,ACE),是一種含鋅屬二肽羧肽酶,主要作用是催化血管緊張素I轉化為血管緊張素II,使緩激肽失活。近年來,研究發(fā)現其在多種腫瘤中存在差異性表達,參與腫瘤的多種病理生理過程,包括血管生成、細胞生長、遷移和轉移等[1]。使用血管緊張素轉移酶能夠降低腫瘤的發(fā)生[3]。

Varela等測定了135例腫瘤患者和107例健康對照人群的血清ACE活性,發(fā)現腫瘤患者,包括胃腸道腫瘤、乳腺癌、肺癌和頭頸癌血清ACE的活性明顯低于正常對照組,有轉移的肺癌患者中ACE活性明顯低于未轉移的肺癌患者,治療期間患者中ACE活性明顯低于恢復期患者,ACE活性越低,預后越差[4]。國內學者研究證實了該結果[5,6]。由此認為,血清ACE活性可以作為腫瘤標記物,有望成為一種腫瘤臨床診斷和療效觀察的有效指標。ACE基因位于人類第17號染色體長臂q23,其第16內含子存在一段287堿基的插入缺失多態(tài)性,即(I/D多態(tài)性),該多態(tài)性與血漿ACE水平相關,Ⅱ基因型顯著增加了中國人群結直腸癌的發(fā)病風險[7]。以上研究集中在ACE基因和酶活性方面,其轉錄水平的研究較少。

Rocken等運用實時熒光定量PCR檢測到ACE mRNA在結腸癌組織的表達比其在對應的非病變組織的表達高約2.5倍[2]。然而,ACE mRNA與結直腸癌發(fā)生發(fā)展及其臨床病理特征的關系尚未見文獻報道,本研究采用實時熒光定量PCR定量檢測ACE mRNA在結直腸中的表達,發(fā)現ACE mRNA在低分化結直腸癌患者組的表達明顯高于高中分化患者組;在有轉移患者組的表達明顯高于無轉移患者組,表明ACE在結直腸癌的分化和轉移中發(fā)揮著較為重要的作用。雖然目前尚不清楚其準確分子機制,但本研究結果為今后進一步深入研究ACE基因表達與結直腸癌發(fā)病之間的機理奠定了有利的基礎。

[1]Deshayes F,Nahmias C.Angiotensin receptors:a new role in cancer?[J].Trends Endocrinol Metab,2005,16(7):293.

[2]Rocken C,Neumann K,Carl-McGrath S,et al.The gene polymorphism of the angiotensin I-converting enzyme correlates with tumor size and patient survival in colorectal cancer patients[J].Neoplasia,2007,9(9):716.

[3]Lever AF,Hole DJ,Gillis CR,et al.Do inhibitors of angiotensin-I-converting enzyme protect against risk of cancer?[J].Lancet,1998,352(9123):179.

[4]Varela A,Saez JBL.Utility of serum activity of angiotensin-converting enzyme as a tumor marker[J].Oncology,1993,50(6):430.

[5]劉 虹,裴 彰.血清及支氣管肺泡灌洗液中CA-50 CEA ACE檢測對肺癌診斷的價值[J].山西醫(yī)科大學學報,1998(2),29:134.

[6]張 偉.血管緊張素轉化酶檢測對肺癌診斷的臨床意義[J].天津醫(yī)科大學學報,2002,8(3):355.

[7]周 莉,胡 艷,高紅芳,等.結直腸癌患者外周血血管緊張素轉換酶基因多態(tài)性[J].腫瘤防治研究,2010,37(9):1040.