吳淑秀 崔淑華 郝建光 張藝兵 朱萬燕 劉冰 劉玉芳

(1.臨沂出入境檢驗(yàn)檢疫局 山東臨沂 276034;2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局)

水產(chǎn)品中結(jié)晶紫檢測(cè)污染原因分析及應(yīng)對(duì)措施

吳淑秀1崔淑華1郝建光1張藝兵2朱萬燕1劉冰1劉玉芳1

(1.臨沂出入境檢驗(yàn)檢疫局 山東臨沂 276034;2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局)

本研究應(yīng)用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC/MS/MS)測(cè)定了樣品抽取、傳遞和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)過程中常用的筆、紙、標(biāo)簽、樣品袋中結(jié)晶紫(含隱性結(jié)晶紫)的含量。紙?jiān)嚇硬捎靡译嬷苯犹崛?筆試樣采用書寫劃痕后再用乙腈提取,HPLC/MS/MS定量測(cè)定。結(jié)果表明,除樣品袋、濾紙、實(shí)驗(yàn)室無色標(biāo)簽紙和簽字筆中不含有結(jié)晶紫(含隱性結(jié)晶紫)外,其余供試物品均含有一定量的結(jié)晶紫(含隱性結(jié)晶紫),其中A4打印紙、標(biāo)簽紙和圓珠筆中含量很高。為降低取樣和檢驗(yàn)過程中的污染風(fēng)險(xiǎn),本文還對(duì)生產(chǎn)和檢驗(yàn)檢測(cè)各環(huán)節(jié)需要注意的問題做了較為詳細(xì)的分析。本研究結(jié)果將有利于建立有效預(yù)防體系,從而最大程度避免樣品在生產(chǎn)、檢驗(yàn)和檢測(cè)過程中的本底污染和假陽性結(jié)果。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;結(jié)晶紫;隱性結(jié)晶紫;殘留檢測(cè)

1 前言

結(jié)晶紫是一類合成的三苯基甲烷類工業(yè)染料,為消毒防腐藥,有較好的殺菌作用。因其具有高效、價(jià)廉、易得等優(yōu)點(diǎn),它作為化學(xué)消毒劑被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治中,也有人在水產(chǎn)品販運(yùn)過程中使用它們作為消毒劑來延長(zhǎng)魚的存活時(shí)間[1,2]。結(jié)晶紫具有高毒性、高殘留和致癌、致畸變、致突變等毒副作用,美國、韓國、日本、英國等許多國家已禁止其用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[3-7]。如歐盟要求

水產(chǎn)品在運(yùn)達(dá)各成員國邊境時(shí)結(jié)晶紫不得檢出。2008年7月1日,韓國結(jié)晶紫限量由原來的5μg/kg調(diào)整為2μg/kg[8]。由于結(jié)晶紫在進(jìn)入動(dòng)物體后,可以通過生物轉(zhuǎn)化,還原代謝成為脂溶性的隱性結(jié)晶紫,因此隱性結(jié)晶紫也被作為殘留監(jiān)控的重要指標(biāo)[9]。這兩種物質(zhì)在水產(chǎn)品中的殘留檢測(cè)方法主要是采用UPLC和UPLC/MS/MS。然而,在檢測(cè)過程中,經(jīng)常會(huì)碰到試劑空白存在結(jié)晶紫目標(biāo)化合物和未使用過的水產(chǎn)品含有痕量的結(jié)晶紫(含隱性結(jié)晶紫)等現(xiàn)象,究其原因可能是在水產(chǎn)品加工、檢驗(yàn)監(jiān)控樣品抽取、傳遞和樣品檢測(cè)等過程中存在不同程度的目標(biāo)物污染。高華鵬等[10]研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)簽紙、圓珠筆、A4打印紙等實(shí)驗(yàn)室用品中含有一定水平的結(jié)晶紫。李心倩等[11]研究發(fā)現(xiàn)目前國內(nèi)市場(chǎng)上銷售的不同牌號(hào)的藍(lán)色圓珠筆油墨所采用的主要色料是結(jié)晶紫。因此,研究和分析在樣品抽取、傳遞和測(cè)定過程中污染的來源對(duì)于控制樣品生產(chǎn)、抽取、流轉(zhuǎn)和檢測(cè)等過程中污染源對(duì)樣品可能造成的污染、提高該類物質(zhì)痕量分析的技術(shù)水平,以更好地做好樣品監(jiān)控監(jiān)管具有非常重要的意義。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 儀器

Agilent 1200快速液相色譜儀、6410 Triple Quad質(zhì)譜儀(Aglient Techlogies,美國);MilliQ超純水器(Millipore公司,美國);MS 3基本型旋渦混合器(IKA公司,德國);振蕩器(江蘇省金壇市金城教學(xué)儀器廠)。

2.1.2 試劑

結(jié)晶紫(CV)、隱性結(jié)晶紫(LCV)均購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈(色譜純,天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司分公司)、乙酸銨(優(yōu)級(jí)純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);超純水。

2.2 方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量的結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,-18℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制(1μg/mL)

分別準(zhǔn)確吸取1.00mL結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(2.2.1.1)至10mL容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,-18℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液

用乙腈稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(2.2.1.2),配制成每毫升含結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫均為100ng的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,-18℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.1.4 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液

按照需求逐級(jí)稀釋,低濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2.2 樣品的處理

樣品處理分為筆和紙兩部分,紙取2 cm×2 cm大小,用2mL乙腈浸泡振蕩5min,浸提液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用于儀器測(cè)定(有色標(biāo)簽紙中的顏色線條保留為寬2cm,長(zhǎng)2cm的一條);筆的取樣方式為:分別在2 cm×2 cm的無本底含量3張實(shí)驗(yàn)濾紙上分別均勻書寫1、2、4條長(zhǎng)2 cm長(zhǎng)的筆跡(具體操作方式見圖1),晾2min后將該紙用2mL乙腈浸泡,振蕩5 min,浸提液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后用于儀器測(cè)定。

圖1 具體操作方式

2.2.3 色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜柱:Eclipse plus C18柱(2.1 mm×150 mm,粒徑5μm);柱溫:35℃;進(jìn)樣體積:10μL;流動(dòng)相:乙腈:乙酸銨(5mmol/L,pH=4.5)=75:25;流速:0.3 mL/min,等度洗脫。

離子源:ESI,正離子掃描;霧化器壓力:35psi;干燥氣溫度:350℃;干燥氣流速:11mL/min;毛細(xì)管電壓:4000V;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè);監(jiān)測(cè)離子對(duì)、毛細(xì)管出口電壓/碎裂電壓和碰撞能量等質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫質(zhì)譜采集參數(shù)t

2.2.4 線性范圍

分別配制濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣分析,以標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo),響應(yīng)值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程。結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程和相關(guān)系數(shù)

2.2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確添加結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液于實(shí)驗(yàn)室用陰性濾紙中,分別設(shè)3個(gè)添加濃度,每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)重復(fù),混合振蕩5min后,按上述方法測(cè)定,以得到的平均回收率評(píng)價(jià)分析方法的準(zhǔn)確度,以6次測(cè)試結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)價(jià)方法的精密度。

在0.20ng/mL-0.80ng/mL添加水平,實(shí)驗(yàn)室用陰性濾紙中的平均添加回收率為96.0%-103.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%-4.8%(見表3),均在允許范圍內(nèi),符合殘留分析的要求。

表3 結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫添加回收率

2.2.6 方法的檢測(cè)限

對(duì)0.5ng/mL的結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述儀器條件進(jìn)樣分析,分別提取各自定量離子,使用工作站軟件以峰對(duì)峰方法(Pk-pk)自動(dòng)計(jì)算此濃度下的信噪比(S/N)。按S/N=3計(jì)算出結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫的儀器檢測(cè)限分別為0.035ng/mL和0.071ng/mL。由于檢測(cè)方法將樣品提取液定容至2mL,所以本檢測(cè)方法結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫的檢測(cè)限分別為0.07ng/mL和0.14ng/mL。

3 結(jié)果分析

上述供試材料中結(jié)晶紫(含隱性結(jié)晶紫)含量情況見表4。由表4可見,藍(lán)色圓珠筆、A4打印紙以及樣品傳遞標(biāo)簽中均含有較高濃度的結(jié)晶紫(含隱性結(jié)晶紫),其中,藍(lán)色圓珠筆油中結(jié)晶紫(含隱性結(jié)晶紫)含量最高,平均值高達(dá)167.30-406.54 ng/mL;A4打印紙中結(jié)晶紫(含隱性結(jié)晶紫)含量也很高,平均值為38.38ng/mL;樣品傳遞和留存標(biāo)簽中結(jié)晶紫(含隱性結(jié)晶紫)平均含量在0.22-9.02 ng/mL范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品檢測(cè)時(shí)使用的濾紙和無字標(biāo)簽紙中無結(jié)晶紫(含隱性結(jié)晶紫)檢出(低于儀器檢測(cè)低限),留存樣品的塑料袋中不含有目標(biāo)物。但帶有黑色格線和綠色格線的試劑標(biāo)簽中含有1.63-4.88ng/mL結(jié)晶紫(含隱性結(jié)晶紫)。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)過程中使用黑色簽字筆無結(jié)晶紫殘留,黑色記號(hào)筆和藍(lán)色記號(hào)筆中結(jié)晶紫(含隱性結(jié)晶紫)含量也很低,為0.08-0.22ng/mL。

表4 常用取制樣及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)用品中結(jié)晶紫和陰性結(jié)晶紫的含量

本文的目的在于分析和明確水產(chǎn)品中結(jié)晶紫(含隱性結(jié)晶紫)是否存在污染物以及污染物含量高低和污染可能性大小等問題。由于樣品處理的方法所致,實(shí)驗(yàn)測(cè)試得到的含量數(shù)據(jù)大概是原樣品真實(shí)含量的萬分之一到百萬分之一,樣品處理的方法已經(jīng)將含量稀釋了好幾個(gè)數(shù)量級(jí),具體數(shù)據(jù)無法計(jì)算。但是可以明確一點(diǎn),很多測(cè)試樣品中結(jié)晶紫(含隱性結(jié)晶紫)含量很高,而且極易造成污染。

(續(xù)表)

4 應(yīng)對(duì)污染的措施

4.1 水產(chǎn)品生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)的預(yù)防措施

水產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)人員在產(chǎn)品生產(chǎn)的多個(gè)環(huán)節(jié)經(jīng)常接觸含有結(jié)晶紫(含隱性結(jié)晶紫)的筆和紙張等污染源,比如須用筆填寫各種控制記錄、表格和標(biāo)簽,這個(gè)過程中只要接觸到具有高含量結(jié)晶紫(含陰性結(jié)晶紫)的物品,就會(huì)將手上帶有的高濃度目標(biāo)物帶到產(chǎn)品中,對(duì)樣品造成污染。所以生產(chǎn)企業(yè)必須從以下幾點(diǎn)減少污染:(1)在生產(chǎn)的養(yǎng)殖、加工、儲(chǔ)運(yùn)、檢驗(yàn)及銷售等各環(huán)節(jié)堅(jiān)決杜絕圓珠筆的使用;(2)用手接觸生產(chǎn)各環(huán)節(jié)用到的各種紙制規(guī)程、文件和表格后,要嚴(yán)格洗手工序,設(shè)專人負(fù)責(zé)監(jiān)督。另外,盡量將單頁文件用塑料夾存放,以減少A4紙帶來的污染;(3)各生產(chǎn)環(huán)節(jié)用到的標(biāo)簽設(shè)計(jì)盡量簡(jiǎn)潔,標(biāo)簽經(jīng)專人粘貼后用塑料粘紙等將標(biāo)簽嚴(yán)密封閉,以減少污染;(4)對(duì)員工進(jìn)行重點(diǎn)培訓(xùn),加強(qiáng)員工防范意識(shí),從源頭控制污染源。

4.2 水產(chǎn)品抽樣環(huán)節(jié)的預(yù)防措施

檢驗(yàn)監(jiān)管人員在仟取樣品、傳遞樣品等過程中也會(huì)接觸到多種結(jié)晶紫(含隱性結(jié)晶紫)污染源,因此也應(yīng)規(guī)范做好對(duì)企業(yè)員工的四點(diǎn)要求。另外,特別需要注意的是,應(yīng)確保冷凍檢測(cè)樣品到達(dá)檢測(cè)崗位之前處于良好狀態(tài)。如果樣品解凍,樣品袋上容易出現(xiàn)大量凝結(jié)的水滴,由于結(jié)晶紫是水溶性物質(zhì),樣品袋標(biāo)簽、筆墨中含有的結(jié)晶紫很容易隨水溶解析出。這時(shí)如果樣品袋密封不嚴(yán)或檢測(cè)人員將樣品袋放在案板后再打開樣品進(jìn)行處理就會(huì)造成結(jié)晶紫污染樣品。

4.3 水產(chǎn)品檢測(cè)環(huán)節(jié)的預(yù)防措施

樣品在實(shí)驗(yàn)室流轉(zhuǎn)過程中存在很多環(huán)節(jié)會(huì)造成樣品污染:樣品流轉(zhuǎn)的標(biāo)記,實(shí)驗(yàn)人員手、筆、標(biāo)簽紙、樣品、瓶瓶罐罐等的輪流接觸,以及實(shí)驗(yàn)用品的混合清洗。實(shí)驗(yàn)室人員必需做好以下幾方面工作:(1)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)所使用的試劑耗材、記號(hào)筆、標(biāo)簽紙等進(jìn)行合格評(píng)定,明確檢測(cè)環(huán)境中結(jié)晶紫背景值,盡可能杜絕使用任何含有結(jié)晶紫的試劑耗材等,整個(gè)實(shí)驗(yàn)室堅(jiān)決杜絕使用任何型號(hào)的圓珠筆;(2)在清洗樣品分析使用的實(shí)驗(yàn)用品時(shí),需先將容器外邊的可能污染源(如簽字筆標(biāo)記、樣品標(biāo)簽紙等)隨活水清洗掉,然后再放入超聲波清洗;(3)嚴(yán)格對(duì)每批檢測(cè)樣品進(jìn)行質(zhì)量控制,每批樣品必須同時(shí)進(jìn)行試劑空白、陰性樣品實(shí)驗(yàn),若空白中出現(xiàn)目標(biāo)化合物、陰性樣品本底值增高、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性差等情況時(shí),需反復(fù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,分析可能存在的原因,必要時(shí)應(yīng)重新抽樣。

本文研究結(jié)果表明,結(jié)晶紫(含隱性結(jié)晶紫)在日常用品中廣泛存在,這對(duì)食品安全殘留檢測(cè)工作構(gòu)成了多元化的污染,所以出臺(tái)食品接觸物中該類物質(zhì)的法規(guī)限量標(biāo)準(zhǔn)是值得相關(guān)部門考慮的首要問題。

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The Reason Analysis and Counter Measures of Detecting Pollution of Crystal Violet in Aquatic Products

Wu Shuxiu1,Cui Shuhua1,Hao Jianguang1,Zhang Yibing2,Zhu Wanyan1,Liu Bing1,Liu Yufang1

(1.Linyi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Linyi,Shandong,276034;2.Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau)

The high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(HPLC/MS/MS)was used in determination of crystal violet(including leucocrystal vioet)in the pen,paper,label and sample bag which were used commonly in the course of sample sampling,transfer and laboratory tests.The paper sample were extracted by acetonitrile,and for pen samples,the marks written by pen was extracted by acetonitrile,then analyzed by UPLC/MS/MS.Though the sample bag,filter paper,laboratory colorless and label pen do not contain crystal violet(including leucocrystal vioet),the other test items contain a certain amount of crystal violet(including leucocrystal vioet)in which the amount of rystal violet(including leucocrystal vioet)in A4printing paper,label paper and ball pen were at high levels.In order to reduce the risk of pollution in the course of sampling and determination,the problems that should be pay attention to in sample production and determination stage were discussed in detail.The results of this study will help to establish an effective preventative system avoiding the sample background contamination and false-positive results in the sample production,inspection and determination process.

HPLC/MS/MS;Crystal Violet;Leucocrystal Vioet;Residue

TS201.6