侯彩云，趙靜，劉瑩，王旭，黃昕

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)功能乳品教育部北京市共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083）

乳品真蛋白率的提出及測(cè)定

侯彩云，趙靜，劉瑩，王旭，黃昕

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)功能乳品教育部北京市共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083）

利用三氯乙酸-雙縮脲比色法對(duì)添加乳清蛋白乳粉的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，乳清蛋白的加標(biāo)回收率在89.2%～99%之間，重現(xiàn)性在0.26%～0.98%之間，表明三氯乙酸-雙縮脲比色法可以較好地檢測(cè)出乳中的真蛋白。提出了真蛋白率的概念，并測(cè)定出乳粉的真蛋白率范圍在78.06%～89.90%之間；液態(tài)乳的真蛋白率范圍在90.03%～96.25%之間。

三氯乙酸-雙縮脲比色法；凱氏定氮法；蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)；真蛋白率

0 引言

蛋白質(zhì)是乳品質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)[1]。我國(guó)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定乳制品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定方法為凱氏定氮法（簡(jiǎn)稱K法）[2]。根據(jù)其測(cè)定原理，K法的測(cè)定值為樣品中粗蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[3]。正常情況下，乳粉中的非蛋白氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在總氮中所占比例是基本穩(wěn)定的[4，5]。然而，一旦在樣品中添加了非蛋白含氮物，就會(huì)對(duì)K法的測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。K法的這一漏洞曾經(jīng)給一些不法廠商的制假售劣提供了可乘之機(jī)。

與粗蛋白相對(duì)，真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以較好地反映乳的真實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[6]。為此，本研究室提出了一種三氯乙酸-雙縮脲比色法（簡(jiǎn)稱T+B法）[7]，在此基礎(chǔ)上，提出了真蛋白率的概念，以期找到一種可以較為有效地排除包括尿素、三聚氰胺和水解蛋白在內(nèi)的多種非蛋白含氮物對(duì)乳品中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定影響的方法，為鑒別非蛋白含氮物的非法添加提供必要的技術(shù)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

12種市購(gòu)液態(tài)乳；15種市購(gòu)乳粉。

酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）標(biāo)準(zhǔn)品，乳清蛋白（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%），雙縮脲試劑，四氯化碳，三氯乙酸，體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇。

雙縮脲試劑：將濃度為10 mol/L氫氧化鉀10 mL和質(zhì)量濃度為250 g/L酒石酸鉀鈉溶液20 mL加到約800 mL蒸餾水中，劇烈攪拌，同時(shí)緩慢加入質(zhì)量濃度為40 g/L的硫酸銅溶液30 mL，定容至1 000 mL。

硼酸-指示劑混合液：溴甲酚綠0.5 g，甲基紅0.1 g溶解于體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇中，稀釋至100 mL即為硼酸指示劑混合液。

催化劑：五水合硫酸銅10 g，硫酸鉀100 g，在研缽中研磨，過(guò)40目篩。

濃度為0.01 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%硼酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%氫氧化鈉，濃硫酸，亞甲基蘭-甲基紅指示劑。

1.2 儀器

分析天平，電子天平，752型分光光度計(jì)，高速冷凍離心機(jī)(GL220G2Ⅱ)，超聲波清洗器(KQ1002DB)，消煮爐（KXL-1010），定氮儀（KDY-9820）。

1.3 方法

1.3.1 現(xiàn)行國(guó)標(biāo)蛋白質(zhì)測(cè)定方法

分別精確稱取15種乳粉0.2000 g，編號(hào)為1～16，順序加入0.5～0.55 g的催化劑，5 mL的濃硫酸，放在消煮爐上消化；消化完全并待樣品冷卻后，用凱氏定氮儀蒸餾，并用已標(biāo)定的濃度為0.1 mol/L的鹽酸滴定，計(jì)算得到樣品蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。樣品平行測(cè)定3次[8]。

分別精確稱取12種液態(tài)乳1.5000 g，編號(hào)為1～12，順序加入0.5～0.55 g的催化劑，5 mL的濃硫酸，放在消煮爐上消化；消化完全并待樣品冷卻后，用凱氏定氮儀蒸餾，并用已標(biāo)定的濃度為0.2 mol/L的鹽酸滴定，計(jì)算得到樣品蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，記為Pk。樣品平行測(cè)定3次[8]。

1.3.2 T+B法測(cè)定各種乳的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按表1加入酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和雙縮脲試劑，充分混勻。繪制酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品平行測(cè)定3次。

表1 酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1.3.2.2 樣品蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

精確稱取乳粉0.2000 g，置于50 mL離心管中，加入2 mL水溶解均勻。加入15%三氯乙酸溶液5 mL混勻，靜置10 min，10 000 r/min下離心10 min。棄去上清液，加入體積分?jǐn)?shù)為95%無(wú)水乙醇10 mL混勻，10 000 r/min下離心5 min。棄去上清液，加入四氯化碳2 mL和雙縮脲試劑20 mL，用超聲波清洗器震蕩均勻，使蛋白溶解，靜置顯色10 min，10 000 r/min下離心20 min。以0管調(diào)零，540 nm下測(cè)定表1配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值。以各管真蛋白濃度為縱坐標(biāo)，吸光度值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)測(cè)定上述提取蛋白液的吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程讀取試液的真蛋白質(zhì)量濃度c。樣品平行測(cè)定3次。

精確稱取液態(tài)乳1.5000 g，置于50 mL離心管中。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%三氯乙酸溶液5 mL混勻，靜置10 min，10 000 r/min下離心10 min。棄去上清液，加入體積分?jǐn)?shù)為95%無(wú)水乙醇10 mL混勻，10 000 r/min下離心5 min。棄去上清液，加入四氯化碳2 mL和雙縮脲試劑20 mL，用超聲波清洗器震蕩均勻，使蛋白溶解，靜置顯色10 min，10 000 r/min下離心20 min。以0管調(diào)零，540 nm下測(cè)定表1配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值。以各管真蛋白濃度為縱坐標(biāo)，吸光度值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)測(cè)定上述提取蛋白液的吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程讀取試液的真蛋白質(zhì)量濃度c。樣品平行測(cè)定3次[7]。

按下式計(jì)算乳品試樣的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)P0：

式中：P0為乳品中真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；c為試液蛋白質(zhì)量濃度；m0為取樣量。

1.3.2.3 乳清蛋白的添加對(duì)T+B法測(cè)定結(jié)果的影響

精確稱取乳粉0.2000 g 7份，編號(hào)為1-7；按照表2所示分別向其中7份添加乳清蛋白，置于50 mL離心管中，加入2 mL水溶解均勻。加入15%三氯乙酸溶液5 mL混勻，靜置10 min，10000 r/min下離心10 min。棄去上清液，加入95%無(wú)水乙醇10 mL混勻，10000 r/min下離心5 min。棄去上清液，加入四氯化碳2 mL和雙縮脲試劑20 mL，用超聲波清洗器震蕩均勻，使蛋白溶解，靜置顯色10 min，10 000 r/min下離心20 min。以0管調(diào)零，540 nm下測(cè)定表1配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值。以各管真蛋白濃度為縱坐標(biāo)，吸光度值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)測(cè)定上述提取蛋白液的吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程讀取試液的真蛋白質(zhì)量濃度c。樣品平行測(cè)定3次。按1.3.2.2中的公式計(jì)算P0。

表2 乳粉中添加乳清蛋白的配制

1.3.3 乳品真蛋白率的提出與計(jì)算

按下式計(jì)算三氯乙酸-雙縮脲法（T+B法）和凱氏定氮法所測(cè)定乳品蛋白質(zhì)量濃度的比率，記為δP，該值稱為真蛋白率，表示乳品中真實(shí)的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)在粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)中所占的比率。

式中：δP為真蛋白率；P0為真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；Pk為樣品中粗蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 T+B法測(cè)定樣品蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.1.1 乳清蛋白的添加對(duì)T+B法測(cè)定乳粉蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖1是不同添加量的乳清蛋白對(duì)乳粉的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響?？梢钥闯觯S著乳清蛋白添加量的增加，乳粉的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)也相應(yīng)增加，表明T+B法測(cè)定乳粉的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，乳清蛋白被三氯乙酸沉淀了，并且乳清蛋白和酪蛋白一起與雙縮脲試劑發(fā)生顯色反應(yīng)。

圖1 乳粉的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.1.2T+B法測(cè)定乳粉蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)乳清蛋白的回收率和重現(xiàn)性

通過(guò)加入乳清蛋白進(jìn)行定性，可以檢測(cè)到乳清蛋白的加標(biāo)回收率在89.2%～99%之間，重現(xiàn)性在0.26%～0.98%之間。說(shuō)明T+B法測(cè)定添加乳清蛋白的乳粉的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，乳清蛋白可以被較好的定量檢測(cè)出來(lái)。

2.2 兩種方法測(cè)定結(jié)果的比較

表3和表4為凱氏定氮法和T+B法分別測(cè)定的12種液態(tài)乳和15種乳粉的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表3 12種液態(tài)乳的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)%

表4 15種乳粉的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)%

由表3和表4可以看出，凱氏定氮法和T+B法測(cè)定的乳粉和液態(tài)乳的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有一致性。通過(guò)成對(duì)t檢驗(yàn)，|t|＜t(0.05,n)(n=12,15)，說(shuō)明T+B法與凱氏定氮法測(cè)定乳粉和液態(tài)乳蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，兩者不存在顯著性的差異。

2.3 乳品真蛋白率的測(cè)定與分析

圖2和圖3分別是液態(tài)乳和乳粉的真蛋白率測(cè)定結(jié)果。由圖2可以看出，液態(tài)乳的真蛋白率范圍在90.03%～96.25%之間，表明液態(tài)乳中非蛋白含氮物在粗蛋白中所占的比例并非定值，可能會(huì)因各種因素的影響，在一定的范圍內(nèi)有所波動(dòng)。由圖3可以看出，乳粉的真蛋白率范圍在78.06%～89.90%之間，表明乳粉的真蛋白率普遍低于液態(tài)乳。之所以如此，一方面可能是因?yàn)榧庸すに嚨男枰?，另一方面也可能是存在人為添加非蛋白含氮物的結(jié)果。與粗蛋白相比，真蛋白可以更加直觀地反映乳品的真實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。對(duì)于市售乳品而言，真蛋白率應(yīng)該穩(wěn)定在一定的范圍內(nèi)。如果某種乳品的真蛋白率過(guò)低，表明有可能存在人為添加外源含氮物質(zhì)的情況，應(yīng)通過(guò)對(duì)其中的乳蛋白甚至氨基酸的構(gòu)成進(jìn)行進(jìn)一步分析的方式，以確認(rèn)其質(zhì)量是否名實(shí)相符。

圖2 液態(tài)乳的真蛋白率

圖3 乳粉的真蛋白率

3 結(jié)論

利用T+B法對(duì)添加乳清蛋白乳粉的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，乳清蛋白的加標(biāo)回收率在89.2%～99%之間，重現(xiàn)性在0.26%～0.98%之間，重現(xiàn)性較好，表明T+B法可以較好地檢測(cè)出乳中的真蛋白。

凱氏定氮法和T+B法測(cè)定乳品的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有一致性。提出了真蛋白率的概念，對(duì)于不同乳品而言，真蛋白率應(yīng)穩(wěn)定在一定的范圍內(nèi)，如果某種乳品的真蛋白率測(cè)定值與其合理的范圍偏差過(guò)大，則說(shuō)明該乳品可能存在人為添加非蛋白含氮物的情況。對(duì)所收集樣品的測(cè)定，表明乳粉的真蛋白率在78.06%～89.90%之間；液態(tài)乳的真蛋白率在90.03%～96.25%之間。

[1] 程濤，孫艷波，李健.雙縮脲法測(cè)定乳中酪蛋白含量[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2000，28(3)：33-35.

[2] 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).GB 5009.5-2010，食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[3] 盛成樂(lè).關(guān)于凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的幾個(gè)問(wèn)題[J].中國(guó)釀造，2002（2）：43-44.

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[6] 劉東紅，唐佳妮，呂元，等.乳品真蛋白—定義、分析方法、計(jì)價(jià)及影響因素[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2008，8（5）：115-119.

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Determination on the ratio of true protein in milk products

HOU Cai-yun,ZHAO Jing,LIU Ying,WANG Xu,HUANG Xin
(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

The protein content is determined by trichloroacetic acid－biuret method in milk powder.The recovery of whey protein is 89.2%～99%and the detection limit is 0.26%～0.98%,which shows the true protein can be well determined by trichloroacetic acid－biuret method.The concept of true protein ratio is proposed,and the true protein ratio in the milk powder and raw milk is 78.06%～89.90%and 90.03%～96.25%respectively.

trichloroacetic acid-biuret method；Kjeldahl nitrogen method；the protein content；true protein ratio

TS252.1，TS252.7

A

1001-2230（2011）02-0056-03

2010-11-15

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2009GB23600525）。

侯彩云（1963-），女，教授，從事食品質(zhì)量安全方面的研究。