張健，張莉，楊貞耐,

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，國(guó)家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心，長(zhǎng)春130033）

生物技術(shù)在干酪加工中的應(yīng)用

張健1，張莉2，楊貞耐1,2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，國(guó)家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心，長(zhǎng)春130033）

綜述了生物技術(shù)在原料乳品質(zhì)改進(jìn)、凝乳酶、干酪發(fā)酵劑、干酪促熟、干酪包裝及乳清處理等不同干酪加工環(huán)節(jié)中的應(yīng)用。

干酪加工；生物技術(shù)；凝乳酶；乳酸菌

0 引言

幾千年前，人們用自然發(fā)酵乳制作原始的新鮮干酪。后來(lái)用動(dòng)物胃臟或植物等的提取物作凝乳劑，使干酪經(jīng)自然發(fā)酵成熟獲得各種風(fēng)味的產(chǎn)品。其制作過(guò)程從人們學(xué)會(huì)做干酪就伴隨著生物技術(shù)的使用，如凝乳劑中酶的作用和發(fā)酵過(guò)程中微生物的作用等。近幾十年來(lái)，生物技術(shù)的快速發(fā)展，基因工程、發(fā)酵工程和細(xì)胞工程等新技術(shù)在干酪加工中的廣泛應(yīng)用，極大地促進(jìn)了干酪種類、風(fēng)味和功能性的多樣化、干酪品質(zhì)的改進(jìn)及干酪產(chǎn)量的提高，從而滿足不同消費(fèi)者對(duì)干酪品質(zhì)的特殊需求及干酪需求量的增加。本文重點(diǎn)綜述了近年來(lái)不同干酪加工環(huán)節(jié)包括原料乳品質(zhì)改進(jìn)、凝乳處理中微生物酶和功能乳酸菌的應(yīng)用、乳清處理、干酪成熟和包裝等有關(guān)生物技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展。

1 原料乳組分的調(diào)控

原料乳的成分組成和衛(wèi)生質(zhì)量直接影響干酪的品質(zhì)。隨著牛全基因組測(cè)序完成，利用生物技術(shù)通過(guò)改造乳畜泌乳相關(guān)基因?qū)θ槌煞诌M(jìn)行調(diào)控從而獲得更適于干酪生產(chǎn)的原料乳，已成為當(dāng)前乳品科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。如表一所示，對(duì)酪蛋白基因磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白分子有關(guān)凝乳酶或血纖維蛋白溶酶的酶切位點(diǎn)進(jìn)行修飾，可以改變酪蛋白的酶解特性，改進(jìn)干酪的品質(zhì)。Brophy等[1]通過(guò)轉(zhuǎn)染將解碼κ，β-酪蛋白基因的DNA轉(zhuǎn)入母牛纖維細(xì)胞內(nèi)，增加母牛體內(nèi)解碼κ，β-酪蛋白基因量，使所產(chǎn)乳中β-酪蛋白的含量增加8%～20%，κ-酪蛋白的含量增加一倍，用該乳制作的干酪與普通牛乳干酪品質(zhì)基本相同。據(jù)Van Slyke&Price公式,100 kg該牛乳比普通牛乳干酪產(chǎn)量提高0.7 kg左右。通過(guò)基因調(diào)控手段減少乳畜的乳糖分泌，可提高乳中干物質(zhì)含量及干酪產(chǎn)率，據(jù)報(bào)道，如果乳中αs1酪蛋白含量增加20%，干酪的年產(chǎn)值將增加2億美元[2]。

一般來(lái)說(shuō)，遺傳性狀優(yōu)良的奶牛產(chǎn)乳量較高，所產(chǎn)乳中固形物含量以及乳中蛋白和脂肪含量也高于普通牛乳[3]。Lipkin等[4]發(fā)現(xiàn)牛乳產(chǎn)量與蛋白產(chǎn)量?jī)蓚€(gè)性狀間關(guān)聯(lián)較大。但乳中過(guò)高的干物質(zhì)含量在擠奶時(shí)會(huì)給乳畜帶來(lái)痛苦，原料乳處理時(shí)也容易“糊鍋”。高產(chǎn)奶牛的篩選應(yīng)在遺傳選育的基礎(chǔ)上結(jié)合飼養(yǎng)條件等指標(biāo)綜合考慮，單一利用遺傳手段篩選，會(huì)出現(xiàn)牛乳產(chǎn)量提高，牛的成活率和生育能力下降，總體經(jīng)濟(jì)效益變差的情況[5]。Shalloo等[6]實(shí)驗(yàn)表明，低產(chǎn)奶牛減量精料飼養(yǎng)，高產(chǎn)奶牛加量精料飼養(yǎng)可以獲得最大經(jīng)濟(jì)回報(bào)。

Scharfen等[7]利用轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)含有溶菌酶的羊乳，該酶不影響乳酸菌生長(zhǎng)，但能有效地減少乳中有害菌數(shù)量，延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期。通過(guò)給母羊注射轉(zhuǎn)基因牛生長(zhǎng)激素（100 mg/14 d），母羊產(chǎn)乳量顯著增加，無(wú)不良副作用。通過(guò)凝乳前在原料乳中加入真菌磷酸脂酶，可減少排乳清過(guò)程中脂肪的流失，增加了Mozzarella干酪的產(chǎn)量[8]。

2 凝乳酶的研究開(kāi)發(fā)

凝乳酶是干酪加工的必需酶制劑。傳統(tǒng)從未斷奶小牛皺胃中提取的皺胃酶已無(wú)法滿足干酪生產(chǎn)發(fā)展的需要。目前約有80%的干酪生產(chǎn)使用微生物或基因工程凝乳酶，大大地緩解了凝乳劑短缺的局面?；蚬こ棠槊妇哂挟a(chǎn)量高、純度高、成本低和生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，用其生產(chǎn)的干酪在風(fēng)味和質(zhì)地上與牛皺胃酶無(wú)差別。目前常用的商品凝乳酶包括黑曲霉凝乳酶和乳酸克魯維酵母工程菌產(chǎn)的基因工程牛凝乳酶等。

凝乳酶基因（牛、羊和真菌等）已在不同宿主中得到成功表達(dá)。牛凝乳酶和微小毛霉凝乳酶在畢赤酵母中得到了表達(dá)[9]。將凝乳酶基因轉(zhuǎn)入羊體，使此轉(zhuǎn)基因羊分泌的乳中含有凝乳酶[10]，該酶與牛凝乳酶有相似特性，適于干酪加工[11]。為了提高凝乳酶表達(dá)量，可對(duì)酶進(jìn)行糖基化修飾、改變目的蛋白引導(dǎo)肽、增加目的基因拷貝數(shù)量或采用高密度發(fā)酵技術(shù)等。通過(guò)對(duì)目的蛋白糖基化，可以使低表達(dá)菌株的產(chǎn)酶量提高10倍[12]，但同時(shí)也會(huì)降低酶的凝乳活性[13]。在凝乳酶原的N端連接糖基化位點(diǎn)，既利用糖基化增加凝乳酶的表達(dá)量，又可在凝乳酶活化過(guò)程中去除糖基，獲得較高酶活力[14]。以乳酸克魯維酵母為宿主時(shí)，用α-Factor作信號(hào)肽比其它信號(hào)肽的凝乳酶表達(dá)量高8倍左右[15]。高密度培養(yǎng)草酸青霉菌時(shí)，以蔗糖為碳源，酵母提取物和蛋白胨等為氮源，可獲得較高產(chǎn)量的凝乳酶。米黑毛霉發(fā)酵過(guò)程中連續(xù)補(bǔ)料可使粗酶液酶活提高到1.24 IU/mL[16]。微小毛霉凝乳酶C端Tyr75、Phe111、Vai110等對(duì)酶活性和穩(wěn)定性有較大影響，通過(guò)基因定點(diǎn)突變可以降低凝乳酶的失活溫度，提高凝乳活性[17-19]。此外，已在一些傳統(tǒng)發(fā)酵食物中分離到產(chǎn)凝乳酶的菌株，如中國(guó)米酒中的霉菌，日本納豆中的枯草芽孢桿菌。從土壤中分離的嗜堿擬諾卡氏菌也能夠產(chǎn)生具有凝乳活性的物質(zhì)[20]。

3 乳酸菌的代謝調(diào)控

干酪發(fā)酵劑乳酸菌的功能特性是影響干酪品質(zhì)的重要因素之一。乳酸菌糖代謝的主要產(chǎn)物是乳酸，通過(guò)代謝調(diào)控，可將乳糖轉(zhuǎn)化成低甜度糖或胞外多糖等具有保健功能或?qū)Ω衫屹|(zhì)地有改善作用的物質(zhì)。通過(guò)對(duì)乳酸菌有關(guān)功能基因如lacZ、aldB、mtlD等的調(diào)控，可以使其代謝途徑朝著有利于功能產(chǎn)物如雙乙酰、山梨醇和B族維生素等形成的方向進(jìn)行（見(jiàn)表2）。在乳糖操縱子中插入6-磷酸山梨醇酶合成基因后，干酪乳桿菌能夠利用乳糖產(chǎn)生山梨醇[21]，將該基因轉(zhuǎn)入乳糖水解酶缺陷植物乳桿菌內(nèi)，可使該菌高效地將葡萄糖轉(zhuǎn)化為山梨醇（轉(zhuǎn)化率61%～65%）和甘露糖醇(轉(zhuǎn)化率9%～13%)[22]。利用產(chǎn)胞外多糖菌株制作低脂切達(dá)干酪可使干酪產(chǎn)量增加8.17%，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加9.49%[23]，制作的墨西哥Panela干酪質(zhì)地柔軟，涂抹性更好。同時(shí)通過(guò)乳酸菌基因工程改造，可以增強(qiáng)其對(duì)噬菌體的抵抗作用，提高干酪成熟過(guò)程中乳酸菌的存活數(shù)量，縮短干酪成熟時(shí)間。Pillidge等[24]把含有抗噬菌體基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳酸菌中，獲得了一株具有可傳代噬菌體抗性的乳酸菌。基因組重組后，鼠李糖乳桿菌抗酸能力增強(qiáng)，能夠在pH 3.6條件下生長(zhǎng)，發(fā)酵密度提高了26%[25]。

表2 乳酸菌功能基因調(diào)控

將蛋白酶、肽酶、氨基酸轉(zhuǎn)移酶等基因轉(zhuǎn)入乳酸菌，可增強(qiáng)其對(duì)干酪風(fēng)味的改善作用。把枯草芽孢桿菌的蛋白酶基因轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌后用于制作切達(dá)干酪，可明顯加快干酪的成熟。增加干酪中乳酸菌肽酶的表達(dá)量如氨肽酶、脯氨酰二肽酶等，可減少干酪成熟中產(chǎn)生的苦味[26]。Smit等[27]在20多株常用干酪乳酸菌中發(fā)現(xiàn)2株高產(chǎn)3-甲基丁醛，可增加干酪麥香味。通過(guò)構(gòu)建高產(chǎn)3-甲基丁醛菌株的基因敲除庫(kù)，確定了3-甲基丁醛的解碼基因，將該基因轉(zhuǎn)入3-甲基丁醛缺陷型菌株中，成功得到表達(dá)。Rijnen等[28]把谷氨酸代謝酶的基因轉(zhuǎn)入乳酸菌，使干酪中谷氨酸高效轉(zhuǎn)化為α酮戊二酯，并使羧酸產(chǎn)量提高，增強(qiáng)了干酪的風(fēng)味。增加干酪中乳酸菌氨基酸轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量可以促進(jìn)干酪風(fēng)味的形成。但有些氨基酸酶如胱硫醚酶對(duì)干酪的風(fēng)味促進(jìn)作用有限。此外，Roberts等[29]用2株產(chǎn)nisin的乳酸菌制成的混合發(fā)酵劑，可有效抑制干酪成熟過(guò)程中有害菌的生長(zhǎng)。

4 干酪促熟技術(shù)的應(yīng)用

天然干酪的成熟期較長(zhǎng)。隨著干酪需求量的不斷增加，如何縮短干酪成熟時(shí)間是提高干酪生產(chǎn)效率的關(guān)鍵。常見(jiàn)干酪的促熟方法及其優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表3。在干酪加工過(guò)程中添加外源酶類如凝乳酶、脂酶、蛋白酶和纖溶酶等，可以促進(jìn)酪蛋白的水解，加快干酪成熟。近年來(lái)微膠囊及其緩釋技術(shù)的發(fā)展，為解決添加外源酶的均一性和避免干酪過(guò)度成熟提供了新方法。把中性細(xì)菌蛋白酶、酸性真菌蛋白酶和脂酶組成的酶類混合物，用脂膜包裹加入切達(dá)干酪，2個(gè)月就具有成熟切達(dá)干酪的風(fēng)味。用脫水脂膜包裹Cyprosin加入牛乳中制作Manchego干酪，15天后干酪風(fēng)味明顯增強(qiáng)，苦味并未增加。纖溶酶適用于加工過(guò)程中有高溫處理環(huán)節(jié)的干酪的促熟。高溫處理易使凝乳酶失活，減緩干酪成熟，而纖溶酶可與乳中酪蛋白微粒結(jié)合，耐熱性較好，而且可均勻分布于乳和干酪中，有利于干酪成熟。

表3 常見(jiàn)干酪促熟方法

采用乳糖利用缺陷型（Lac-）或乳糖利用緩慢型（Lacs）乳酸菌作為干酪輔助發(fā)酵劑，既可保持干酪成熟過(guò)程中較高的活菌數(shù)，加快干酪風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生，縮短成熟時(shí)間，同時(shí)不會(huì)由于活菌數(shù)增加而導(dǎo)致干酪過(guò)度酸化。采用乳糖利用缺陷型兼抗噬菌體缺陷性乳酸菌（Lac-Prt-）作為發(fā)酵劑，由于其菌體易于死亡，其中大量酶類物質(zhì)釋放，從而促進(jìn)干酪成熟。采用物理方法如熱處理（60～70℃，15 s）乳酸菌，在不影響其蛋白水解活力的前提下，可降低其產(chǎn)酸能力。冷凍后解凍也可以使乳酸菌死亡，釋放菌體活性酶。在干酪成熟初期，用高壓處理干酪，可以加快干酪的蛋白水解速度和干酪成熟[30]。高壓處理也可使綿羊乳干酪的短鏈脂肪酸數(shù)量增加，改善干酪質(zhì)地，使Mozzarella干酪的成熟時(shí)間縮短，融化溫度降低，改善其流變學(xué)特性。此外，通過(guò)添加溶菌酶，可促進(jìn)菌體釋放蛋白酶和脂酶，或添加氨基酸促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)的形成。開(kāi)菲爾酵母、酵母混合菌株等非干酪發(fā)酵菌株也被用作輔助發(fā)酵菌株來(lái)增加干酪的風(fēng)味。

5 乳清的生物加工處理

干酪生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的乳清。通?？蓪⑷榍鍑婌F干燥制成乳清粉，或經(jīng)過(guò)濃縮進(jìn)一步分離制成乳糖和乳清濃縮蛋白。乳清濃縮蛋白經(jīng)不同蛋白酶處理可獲得具有不同功能特性的蛋白水解物。乳糖作為碳源可用于發(fā)酵生產(chǎn)附加值更高的單細(xì)胞蛋白和其它代謝產(chǎn)物如乙醇、乳酸、維生素和青霉素等，乳糖經(jīng)進(jìn)一步酸解或酶解還可以生產(chǎn)葡萄糖和半乳糖。

近年來(lái)生物技術(shù)的快速發(fā)展大大拓寬了乳清的用途。目前乳清還可用來(lái)生產(chǎn)運(yùn)動(dòng)功能食品、保健類食品和藥品等。將乳清或脫蛋白乳清用于益生菌高密度發(fā)酵，可生產(chǎn)益生菌產(chǎn)品。用開(kāi)菲爾酵母發(fā)酵乳清，并加入1%的黑葡萄提取物使乳清中的乳糖轉(zhuǎn)化率提高6倍[31]。用乳酸克魯維酵母發(fā)酵乳清生產(chǎn)乙醇，質(zhì)量濃度可達(dá)63 g/L[32]。把嗜熱鏈球菌中的β-半乳糖水解酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，所產(chǎn)酶可以用來(lái)高效分解乳清中乳糖[33]。

乳清蛋白可用來(lái)加工可食用包裝材料，制作凝膠保護(hù)劑；經(jīng)過(guò)酸化、擠壓或者酶解后也可以做乳化劑；通過(guò)膜分離和蛋白水解可以得到很多具有生物活性的物質(zhì)。在干酪制作過(guò)程中，乳清經(jīng)微濾處理后可得到不含凝乳酶而富含活性蛋白的濃縮物，其中固形物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)89%，富含β-乳球蛋白，α-乳清蛋白，乳鐵蛋白，糖多肽等，有些組分具有降血壓、緩解疼痛、抗菌免疫等功能。小鼠實(shí)驗(yàn)證明乳清蛋白對(duì)黃曲霉素中毒有明顯緩解作用[34]，還能激活小鼠體內(nèi)的tp53抗癌基因。喂食乳清提取物會(huì)增加牛的紅細(xì)胞數(shù)量，激活臨產(chǎn)牛的免疫系統(tǒng)[35]。乳清蛋白經(jīng)堿性蛋白酶水解生成的短肽具有一定保健功能。利用糜蛋白酶和羧基肽酶可以水解乳清蛋白制備苯丙氨酸，用于治療苯丙酮尿癥。

6 生物包裝材料的應(yīng)用

為了提高干酪保藏或成熟過(guò)程中品質(zhì)的穩(wěn)定性，具有除氧、除二氧化碳、除濕、抑菌、可降解、可食用等多種功能的生物材料在干酪包裝中得到了越來(lái)越多的應(yīng)用。這類材料通過(guò)吸收、分散、半透膜等作用，控制包裝內(nèi)氣體，創(chuàng)造適于干酪成熟和保存的環(huán)境。

除氧材料可以避免干酪中脂肪被氧化后產(chǎn)生的異味。用加入8 mg/g丁羥甲苯的聚乙烯膜包裝Asadero干酪時(shí)，干酪保存100天后氧化氣味未增加[36]。Jakobsen等[37]建立了半硬質(zhì)干酪包裝內(nèi)二氧化碳平衡數(shù)學(xué)模型。抑菌材料主要是通過(guò)在材料中添加食品級(jí)抑菌物質(zhì)，抑制干酪表面有害菌生長(zhǎng)。在干酪包裝材料中添加乳酸球菌細(xì)菌素和那他霉素，使其持續(xù)釋放，可有效地抑制有害菌在Blat’ácké zlato干酪表面的生長(zhǎng)，但該材料不適合表面成熟干酪。用添加那他霉素的PVC材料包裝Kasha干酪，保存5個(gè)月后，未檢測(cè)到大腸桿菌和沙門氏菌等有害菌[38]。在新鮮干酪Fior di Latte表面涂抹表面保護(hù)劑（8%海藻酸鈉，質(zhì)量濃度為0.25 g/L的溶菌酶，50 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉鹽），結(jié)合頂空充氣可使干酪的貨架期延長(zhǎng)3 d。用檸檬提取物、鹽水和海藻酸鈉制成膠狀物，涂抹于Mozzarella干酪表面，可抑制腐敗菌生長(zhǎng)，延長(zhǎng)貨架期。此外，有些干酪包裝材料通過(guò)添加指示劑，在貨架期內(nèi)根據(jù)包裝材料的變色情況，讓消費(fèi)者可以很容易判斷干酪的剩余保存時(shí)間或污染情況。例如由加拿大Mississauga公司生產(chǎn)的Toxin Alert包裝材料可以通過(guò)顏色變化來(lái)確定干酪的細(xì)菌污染狀況。

7 展望

隨著干酪生產(chǎn)的發(fā)展和干酪需求量的不斷增加，生物技術(shù)將在干酪加工各個(gè)環(huán)節(jié)得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)牛全基因組測(cè)序的完成，使很多重要的泌乳基因序列被確定，如控制牛κ-酪蛋白表達(dá)的基因，乳腺炎治愈物的合成基因等。功能性基因序列結(jié)合分子標(biāo)記輔助篩選和基因輔助篩選等技術(shù)，不僅使原有的乳畜選育周期大大縮短，也使按需設(shè)計(jì)乳的組分成為可能。未來(lái)生物技術(shù)將在原料乳蛋白組分調(diào)控、適于不同種類干酪的專用凝乳酶和功能性干酪發(fā)酵劑的開(kāi)發(fā)等方面進(jìn)一步得到應(yīng)用，并將進(jìn)一步提高干酪產(chǎn)率，縮短干酪成熟周期，改善干酪口感和風(fēng)味，開(kāi)發(fā)出更多具有特殊功能和滿足不同消費(fèi)者個(gè)性化需求的干酪新品種。隨著乳清蛋白組分對(duì)人體保健功能的確證，乳清蛋白將得到進(jìn)一步加工利用，如功能性乳清蛋白和活性肽的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，將使乳清的產(chǎn)值大大超過(guò)干酪產(chǎn)品本身，從而改變干酪產(chǎn)業(yè)內(nèi)部格局。“智能化”生物包裝材料和在線快速生物檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)將使干酪產(chǎn)品更安全，品質(zhì)更穩(wěn)定。生物修復(fù)技術(shù)應(yīng)用于干酪生產(chǎn)中廢液和廢物的處理如用來(lái)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和培養(yǎng)濕地等，將進(jìn)一步減輕干酪生產(chǎn)造成的環(huán)境污染，提高干酪的生產(chǎn)效益。

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Application of biotechnology in cheese processing

ZHANG Jian1,ZHANG Li2,YANG Zhen-nai1,2
(1.College of Food Science and Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130118 China;2.Center of A-gro-Food Technology of Jilin Academy of Agricultural Sciences,National R&D Center for Milk Processing,Changchun,130033,China)

The present review focuses on discussing the application of biotechnology in different stages of cheese processing such as improving the raw milk quality,use of recombinant rennet and novel starters,acceleration of cheese ripening,cheese packaging and whey utilization.

cheese processing;biotechnology;rennet;Lactic acid bacteria

TS252.53

B

1001-2230（2011）02-0048-05

2010-11-19

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助（nycytx-0502）；吉林省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（20080228）。

張?。?979-），男，碩士研究生，從事乳品加工研究。

楊貞耐