李學(xué)朋，梁琪，師希雄，馮瑞章，張炎，文鵬程，張衛(wèi)兵*

產(chǎn)凝乳酶微生物的研究概況

李學(xué)朋1，梁琪1，師希雄1，馮瑞章2，張炎1，文鵬程1，張衛(wèi)兵1*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.宜賓學(xué)院發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓644000）

凝乳酶用途廣泛，其來(lái)源主要有動(dòng)物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶，微生物凝乳酶一直是凝乳酶研究的熱點(diǎn)。對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外產(chǎn)凝乳酶真菌、細(xì)菌和放線(xiàn)菌種類(lèi)以及產(chǎn)凝乳酶微生物的選育的研究情況進(jìn)行了綜述，以期為微生物凝乳酶的研究和開(kāi)發(fā)提供參考。

凝乳酶；微生物；選育

凝乳酶是一種從未斷奶的小牛胃中發(fā)現(xiàn)的酸性蛋白酶，在食品、醫(yī)藥和飼料等方面都有應(yīng)用[1]。凝乳酶的主要來(lái)源有動(dòng)物源凝乳酶、植物源凝乳酶和微生物源凝乳酶。動(dòng)物凝乳酶在干酪的生產(chǎn)中使用最早，應(yīng)用最為廣泛，其中使用最廣泛的是小牛皺胃酶，用其生產(chǎn)干酪時(shí)凝乳效果好、出品率高，所產(chǎn)干酪硬度和彈性好、苦味少[2]。但由于原料缺乏，凝乳酶價(jià)格昂貴。植物凝乳酶凝乳作用強(qiáng)，脂肪損失少，收率較高，但制成的干酪?guī)в幸欢ǖ目辔?。微生物由于生長(zhǎng)周期短，受氣候、地域、時(shí)間限制小，用其生產(chǎn)凝乳酶成本較低、提取方便、經(jīng)濟(jì)效益高，可以節(jié)約動(dòng)、植物資源，所以產(chǎn)凝乳酶微生物及其所產(chǎn)凝乳酶一直是人們研究的熱點(diǎn)，已經(jīng)報(bào)道的產(chǎn)凝乳微生物包括真菌、細(xì)菌、放線(xiàn)菌等[3]。

1 產(chǎn)凝乳酶微生物種類(lèi)

1.1 產(chǎn)凝乳酶真菌

20世紀(jì)60年代初人們開(kāi)始研究微生物凝乳酶，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)凝乳酶真菌有多種，其中主要包括米黑毛霉（Mucor miehei）、微小毛霉（Mucor pusillus）、栗疫菌（Endothia parasitica）、白腐菌（Trametes versicolor）、草酸青霉（Penicillium oxalicum）、米根霉（Rhizopus oryzae）、米曲霉（Aspergillus oryzae）等[4]。

1.1.1 米黑毛霉

米黑毛霉凝乳酶由于凝乳活力與蛋白水力的比值較高，廣泛應(yīng)用于乳品工業(yè)[4]。已報(bào)道的產(chǎn)凝乳酶米黑毛霉有多種，包括米黑毛霉CBS 37065、米黑毛霉NRRL 3420、米黑毛霉NRRL 3169[5-8]等。STERNBERG M Z等[5]研究了產(chǎn)凝乳酶米黑毛霉NRRL 3420，結(jié)果表明，其分子質(zhì)量為34～39ku，該酶為酸性蛋白酶，在酸性條件下穩(wěn)定，不是金屬蛋白酶，硫酸鋁對(duì)酶有強(qiáng)烈抑制作用。LAGRANGE A等[6]純化并比較了米黑毛霉CBS 37065和米黑毛霉NRRL 3169凝乳酶的性質(zhì)，兩者分子質(zhì)量相同，但氨基酸序列不一致。SEKER S等[7]對(duì)米黑毛霉NRRL 3420連續(xù)發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，連續(xù)發(fā)酵時(shí)需要每天補(bǔ)給D-葡萄糖0.625g、pH值不需要控制，轉(zhuǎn)速為400r/min，發(fā)酵液酶活可以達(dá)到1.24IU/mL。金娟男等[8]將經(jīng)乙醇分步沉淀所制得的微小毛霉和米黑毛霉凝乳酶進(jìn)行了比較，米黑毛霉凝乳酶的凝乳效果要好于微小毛霉凝乳酶，在高溫和酸性環(huán)境要比微小毛霉凝乳酶穩(wěn)定。

1.1.2 微小毛霉

國(guó)內(nèi)外對(duì)產(chǎn)凝乳酶微小毛霉的研究也較多。1968年，ARIMAK等[9]發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)凝乳酶的微小毛霉（Mucorpusillus），并對(duì)微小毛霉凝乳酶的特性研究，發(fā)現(xiàn)其具有高活力，酶活可達(dá)到4650個(gè)酶活力單位。NOUANI A等[10]研究了溫度、pH值、CaCl2等因素對(duì)一株微小毛霉所產(chǎn)凝乳酶的影響，并與傳統(tǒng)動(dòng)物源凝乳酶進(jìn)行比較，結(jié)果表明，微小毛霉凝乳酶的分子質(zhì)量為49ku，在65℃加熱30min后酶完全失活。最適作用溫度為50℃，高于傳統(tǒng)凝乳酶的42℃，其他特性與傳統(tǒng)動(dòng)物源凝乳酶極為相似[11]。

矯慶華等[12]從19株真菌中篩出一株微小毛霉602，在含有50%～60%麩皮的半固體培養(yǎng)基中，起始pH 5.0～6.7，28℃培養(yǎng)96h，凝乳酶最高活力為17 000U/g麩皮。補(bǔ)加葡萄糖、蔗糖、硫酸銨、乳清粉均對(duì)酶的產(chǎn)生無(wú)顯著影響。酶的凝乳活力與蛋白水解活力作用的最適溫度均為65℃，此酶具有較高的凝乳活力對(duì)蛋白水解活力的比值，凝乳酶的pH值穩(wěn)定范圍為4.0～8.0，凝乳酶在60℃保溫5min，活力完全喪失。微小毛霉凝乳酶經(jīng)乙醇沉淀、CM-纖維素、DEAESephadex A25和Sepharose 2B柱層析純化后，酶的比活提高，蛋白質(zhì)收率為17.9%。酶的分子質(zhì)量為41.8ku，酶對(duì)血紅蛋白的米氏常數(shù)Km值為0.019mmol/L，酶的等電點(diǎn)為pH4.3。酶的化學(xué)修飾表明，酪氨酸、組氨酸、色氨酸、精氨酸以及巰基與酶的活性無(wú)關(guān)，天冬氨酸的羧基是酶的必需基團(tuán)，故此酶是一種典型的天冬氨酸蛋白酶[12]。

1.1.3 栗疫菌

栗疫菌（Endothia parasitica）產(chǎn)凝乳酶研究相對(duì)較少。SARDINAS J L等[13]從381株細(xì)菌和540株真菌中篩選出了一株產(chǎn)凝乳酶的栗疫菌。栗疫菌凝乳酶分子質(zhì)量為34～39ku；等電點(diǎn)為pH4.5；在60℃加熱5min后完全失活；在pH 5.0時(shí)最為穩(wěn)定。在凝乳酶的蛋白水解作用中，栗疫菌凝乳酶能夠產(chǎn)生丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸等多種氨基酸，但不能產(chǎn)生色氨酸。HAGEMEYER K等[14]用2種方法對(duì)栗疫菌凝乳酶進(jìn)行了純化，該酶在pH 4.0～5.0時(shí)很穩(wěn)定，pH 7.0時(shí)不穩(wěn)定，分子質(zhì)量37.5ku，等電點(diǎn)為pH 4.6。LARSON M K等[15-16]研究了影響栗疫菌凝乳酶活力與穩(wěn)定性的因素，包括pH值、溫度和底物濃度等。

1.1.4 根霉

產(chǎn)凝乳酶的根霉也是一個(gè)研究熱點(diǎn)。KUMAR S等[17]對(duì)一株米根霉的胞外凝乳酶進(jìn)行了分離純化，并研究了其酶學(xué)特性。該酶經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽析、離子交換層析和凝膠層析之后，純化91倍，回收率為26%。酶的最適作用溫度為60℃，活化能為63.37J/mol，在30～45℃范圍內(nèi)酶保持穩(wěn)定；酶的最適作用pH為5.5，在pH 5.5～7.5范圍內(nèi)凝乳酶保持了96%的活力。Ca2+的濃度和酶作用底物濃度與凝乳酶活力之間為雙曲線(xiàn)效應(yīng)。以脫脂乳為反應(yīng)底物時(shí)，酶的米氏常數(shù)Km為5mg/mL。該凝乳酶能夠被胃蛋白酶抑制劑抑制其凝乳酶活力，證明其為天門(mén)冬氨酸蛋白酶。吳進(jìn)菊等[18]從中國(guó)曲中分離出產(chǎn)凝乳酶的根霉F34，進(jìn)一步研究表明，根霉F34菌株凝乳酶最適作用溫度為50℃，最適作用pH值為5.5，Ca2+、Zn2+、Fe2+和Fe3+對(duì)凝乳活力有明顯促進(jìn)作用，K+和Mg2+對(duì)凝乳活力促進(jìn)作用不明顯，而Na+、Cu2+、Co2+和Li2+對(duì)凝乳活力有明顯抑制作用。經(jīng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化，確定了根霉F34產(chǎn)凝乳酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為米粉麩皮水解液4.5%，豆粉水解液4.0%，CaCl20.3%，KCl 0.5%；最適發(fā)酵條件：初始pH值為4.5，發(fā)酵溫度為34℃，培養(yǎng)時(shí)間為60h。滕國(guó)新等[19]采用體積分?jǐn)?shù)60%和71%乙醇分級(jí)沉淀方法分離酒曲根霉（Rhizopussp.）052凝乳酶，酶蛋白總回收率可以達(dá)到51.9%。分別得到凝乳酶活力為14.55U/mg和18.44U/mg的兩種組分。進(jìn)一步使用葡萄糖凝膠（Sephadex）G-100和DE-52提純凝乳酶，得到純酶蛋白根霉B4M2凝乳酶，分子質(zhì)量為36.6ku。Edman降解法測(cè)定酶蛋白分子N-末端15個(gè)氨基酸為GTGSVPVTDYQNDVE。根霉B4M2凝乳酶在pH1～7范圍內(nèi)、4℃條件下凝乳酶活力保持穩(wěn)定。酶作用的最適溫度為40℃，55℃保持20min完全失去活性。根霉B4M2凝乳酶凝乳能力與小牛凝乳酶相近，蛋白水解能力介于小牛凝乳酶與蛋白酶之間。

1.1.5 其他

除了以上幾種研究較多的產(chǎn)凝乳酶真菌外，另外有報(bào)道某些米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、青霉（Penicillium）、白腐真菌（Trametes versicolor）、亞粘團(tuán)串珠鐮刀（Fusarium subglutinans）、擔(dān)子菌（Basidiomycetes）、乳白耙菌（Irpex lacteus）、魯氏淀粉霉（Amylomyces rouxii）等也能產(chǎn)生凝乳酶[20-27]。

表1 不同真菌凝乳酶的特性Table 1 Characteristics of different fungi rennet

1.2 產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌

國(guó)內(nèi)外對(duì)產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌的研究也比較早，主要集中在產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌的分離、凝乳酶的酶學(xué)性質(zhì)、分離純化和培養(yǎng)條件優(yōu)化等。已報(bào)道的產(chǎn)凝乳細(xì)菌主要是芽孢桿菌屬的細(xì)菌。

1.2.1 多粘芽孢桿菌

最早報(bào)道的產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌是多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa），與小牛凝乳酶相比，多粘芽孢桿菌凝乳酶蛋白質(zhì)水解程度大，乳清發(fā)生渾濁，干酪產(chǎn)生苦味。MATTA H等[28]報(bào)道了多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）B-17能夠產(chǎn)生胞外凝乳酶，且所產(chǎn)凝乳酶具有很好的耐熱性，最適作用溫度為50℃，最適pH為7.5，分子質(zhì)量為30ku。

1.2.2 枯草芽孢桿菌

國(guó)內(nèi)外報(bào)道較多的產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。LAVU K R[29]通過(guò)凝膠過(guò)濾和離子交換層析將Bacillus subtilisK-26凝乳酶純化了24倍，經(jīng)十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）凝膠電泳測(cè)定酶分子質(zhì)量為27 000ku對(duì)κ-酪蛋白的Km為2.77mg/mL，酶最適作用pH 7.5，最適作用溫度60℃，60℃處理30min酶失活，乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）可使酶不可逆失活，二異丙基氟磷酸（diisopropylfluorophosphate，DFP）對(duì)酶沒(méi)有影響，重金屬離子Hg2+和Pb2+可使酶失活。DUTT K等[30]從土壤中分離得到一株產(chǎn)凝乳酶枯草芽孢桿菌，具有較高的凝乳酶活力（milk-clotting activity，MCA）/蛋白水解酶活力（protease activity，PA）（MCA/PA）值。研究結(jié)果表明，酪蛋白對(duì)凝乳酶的產(chǎn)生具有誘導(dǎo)作用，果糖和硝酸銨能夠促進(jìn)產(chǎn)酶。在培養(yǎng)基（4%果糖、0.75%酪蛋白、0.3%NH4NO3、10mmol CaCl2，pH 6.0）中接種4%（v/v）的種子液，37℃、200r/min培養(yǎng)72h時(shí)酶活達(dá)到最高，為571.43U/mL。對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化后凝乳活力提高了6.67倍。

胡永金等[31]從采集自云南省的幾個(gè)奶牛場(chǎng)的土壤樣品篩選得到112株產(chǎn)凝乳酶微生物，其中細(xì)菌22株，一株枯草芽孢桿菌BB-23產(chǎn)凝乳酶活力高而蛋白水解活力低，該菌在麩皮培養(yǎng)基發(fā)酵72h后凝乳酶活力達(dá)73.80SU。劉河濤[32]從所采集的10種土壤和干酪樣品中分離純化出的34株微生物中，篩選出能產(chǎn)凝乳酶的枯草芽孢桿菌QL-2，其凝乳活力能達(dá)到62.83SU。

1.2.3 地衣芽孢桿菌

TREVOR M等[33]從生乳中分離得到一株產(chǎn)胞外凝乳酶的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。采用70%硫酸銨對(duì)該菌株所產(chǎn)凝乳酶進(jìn)行了初步純化，進(jìn)一步研究表明，最適作用溫度為65℃，最適pH為5.0～5.5，65℃作用3min后酶失活。AGEITOS J M等[34]純化并研究了地衣芽孢桿菌USC13凝乳酶的酶學(xué)性質(zhì)。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)地衣芽孢桿菌USC1能產(chǎn)生62ku的凝乳蛋白酶源，成熟后分子質(zhì)量變?yōu)?4ku。

宋曦等[35]利用改進(jìn)的酪蛋白培養(yǎng)基分離得到的地衣芽孢桿菌D3.11在發(fā)酵72h時(shí)凝乳酶活力達(dá)89.56SU/mL，經(jīng)優(yōu)化后凝乳活力提高到134.72SU/mL[36]。

1.2.4 球形芽孢桿菌

EL-BENDARY MA等[37-38]采用丙酮分級(jí)沉淀、DEAESephadex A-25和Sephadex G-100將球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）NRC24凝乳酶純化了48倍，活力達(dá)到648 148U/mg。該酶在pH5.7～7.5、溫度為55℃時(shí)達(dá)到最高。Zi2+對(duì)酶有激活作用，Ni2+和Hg2+對(duì)酶有抑制作用。CaCl2在一定濃度范圍內(nèi)可以使酶激活，NaCl在5%～20%范圍內(nèi)使酶抑制。

1.2.5 黃色粘球菌

CARIAS J R等[39]報(bào)道了一株黃色粘球菌（Myxococcus xanthus）DK101，該菌能產(chǎn)生內(nèi)切蛋白酶，與凝乳酶一樣能特異性地水解Phe-Met之間的肽鍵，分子質(zhì)量為45ku。PETIT F等[40]研究了黃色粘球菌DK1622產(chǎn)胞外凝乳酶的條件，結(jié)果表明，該菌在pH 6.0時(shí)酶活最高。在發(fā)酵時(shí)間接近9h時(shí)酶活達(dá)到最高，酶活與菌體量不呈正相關(guān)。POZA M等[41-42]從4株黃色粘球菌中篩選得到一株黃色粘球菌422，該菌產(chǎn)生的凝乳酶分子質(zhì)量為40ku，等電點(diǎn)為5.0，最適pH為6.0，最適溫度為37℃，65℃處理12min后酶可完全失活。

1.2.6 糞腸球菌

SATO S等[43]從157株乳酸菌中篩選得到一株產(chǎn)凝乳酶的糞腸球菌（Enterococcus faecalis）TUA2495L，具有較高的MCA/PA值。所產(chǎn)凝乳酶分子質(zhì)量為34～36ku，等電點(diǎn)為5.4，Km值為0.61%。最適作用溫度為70℃，在pH5.5～10.0的范圍內(nèi)酶比較穩(wěn)定，F(xiàn)e2+、Cd2+、Ni2+、Cu2+、Al3+、SDS和EDTA對(duì)酶有抑制作用，Co2+、Mn2+和Zn2+對(duì)酶有激活作用。

1.2.7 蠟狀芽孢桿菌

周俊清[44]從采集自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)奶牛場(chǎng)的牛棚中、養(yǎng)牛場(chǎng)院內(nèi)、排水溝的土壤樣品中分離得到一株蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）BZ-17，對(duì)其進(jìn)行了誘變選育、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化和酶學(xué)性質(zhì)研究。

表2 不同細(xì)菌凝乳酶的特性Table 2 Characteristics of different bacteria rennet

1.3 產(chǎn)凝乳酶放線(xiàn)菌

產(chǎn)凝乳酶放線(xiàn)菌主要有嗜熱放線(xiàn)菌（Thermoactinomyces）、小單孢菌屬（Micromonospora）、擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsissp.）等。

郭光遠(yuǎn)等[45]在對(duì)云南不同地區(qū)放線(xiàn)菌區(qū)系及資源的考察過(guò)程中，對(duì)所分離到的2 127株放線(xiàn)菌中凝乳酶產(chǎn)生菌進(jìn)行了篩選，產(chǎn)酶菌株有356株，占其中49株產(chǎn)酶活力較高。62%的高溫鏈霉菌菌株產(chǎn)生凝乳酶，產(chǎn)酶活力大于100U/mL的菌株占5.2%；中溫鏈霉菌有11.3%的菌株產(chǎn)生凝乳酶，活性較高的占2.2%。小單胞菌、諾卡氏菌、馬杜拉放線(xiàn)菌和高溫放線(xiàn)菌等也有產(chǎn)生凝乳酶活性較高的菌株。盡管水生放線(xiàn)菌產(chǎn)酶菌株的比例較高，但高活力的菌株多數(shù)來(lái)自土壤。

CAVALCANTI M T H等[46-47]研究了諾卡氏菌屬所產(chǎn)凝乳酶的部分純化和酶學(xué)特性。經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽析后，酶的純化倍數(shù)為7.2，產(chǎn)率為55.3%；經(jīng)過(guò)DEAE-cellulose純化后得到4個(gè)活性部分（F4、F5、F6、F7），其中F5部分表現(xiàn)了最好的凝乳酶活性。酶的最適凝乳pH分別為11.0和7.5，最適凝乳溫度為55℃，在pH 4.5～11.0范圍內(nèi)都比較穩(wěn)定，在65℃和75℃加熱30min后失活。諾卡氏菌（Nocardiopsissp.）在含豆餅粉1%、不含葡萄糖的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40h時(shí)凝乳酶活力達(dá)到最高，為24.49 U/mg。

2 產(chǎn)凝乳酶微生物的誘變選育

目前關(guān)于高產(chǎn)凝乳酶微生物的誘變育種的研究大多集中在真菌如微小毛霉、黑曲霉、米黑毛霉等。誘變育種的所采用的方法主要有60Co-γ射線(xiàn)誘變、紫外線(xiàn)照射誘變、脫氧膽酸鈉誘變、常壓低溫等離子體誘變、微波輻照誘變和NTG誘變等。郭光遠(yuǎn)等[45]以毛霉Y85-8512作為出發(fā)菌，經(jīng)誘變選育得到酶活比值高且凝乳活力可達(dá)到5 000U/g的菌株。孫建等[48]從17株產(chǎn)凝乳酶的霉菌中通過(guò)放射誘變選出1株高產(chǎn)菌株，再進(jìn)行60Co-γ射線(xiàn)誘變，得到的變異株R132的凝乳活力提高了80%，酶活比值提高了65%。廖亮等[49]以米黑毛霉和黑曲霉為出發(fā)菌株，分別進(jìn)行紫外線(xiàn)照射誘變、脫氧膽酸鈉誘變和常壓低溫等離子體誘變，選育一株凝乳酶產(chǎn)量高，蛋白質(zhì)水解活力小的黑曲霉L-2-12。邵淑娟等[50]采用微波輻照方法對(duì)產(chǎn)凝乳酶的黑曲霉JG進(jìn)行誘變處理，選育出的突變株WB6-3、WB2-5，凝乳活力分別比出發(fā)菌株提高了35%和14%。

3 微生物凝乳酶的底物專(zhuān)一性和結(jié)構(gòu)

不同來(lái)源的凝乳酶由于其對(duì)作用底物的專(zhuān)一性不同，在凝乳時(shí)對(duì)κ-酪蛋白的水解位點(diǎn)不同，其在酶解階段的凝乳機(jī)理也不相同。豬胃蛋白酶A和C凝乳酶與小牛皺胃酶相同，水解κ-酪蛋白的目標(biāo)肽鍵均為Phe105～Met106[51]。萵苣凝乳酶水解κ-酪蛋白的靶位點(diǎn)為Arg97～His98、Lys111～Lys112或Lys112～Asn113的肽鍵[52]，合歡凝乳酶則偏好水解Lys116～Thr117[53]。菜薊凝乳酶對(duì)牛和綿羊κ-酪蛋白的主要裂解位點(diǎn)是Phe105～Met106，但對(duì)山羊κ-酪蛋白的裂解位點(diǎn)是Lys116～Thr117[54]。在已報(bào)道的微生物凝乳酶中，栗疫菌（C.parasitica）蛋白酶水解κ-酪蛋白的目標(biāo)肽鍵是Ser104～Phe105[55]；米黑毛霉（R.miehei）凝乳酶水解κ-酪蛋白的目標(biāo)肽鍵為Phe105～Met106[51]。

已報(bào)道的凝乳酶氨基酸序列和結(jié)構(gòu)均有一定的差異。牛源凝乳酶為單鏈，有323個(gè)氨基酸殘基，而雪白毛霉（R.niveus）、高大毛霉（M.mucedo）、佐氏曲霉（A.saitoi）、米黑毛霉（R.miehei）、微小毛霉（R.pusillus）、栗疫菌（C.parasitica）凝乳酶分別含有391、400、394、430、427、419個(gè)氨基酸殘基。牛源凝乳酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中主要包含β-折疊和一些小的α-螺旋片，由N端區(qū)域和C端區(qū)域以雙葉折疊的方式形成了帶有活性位點(diǎn)Asp32和Asp215的分裂溝。菜薊凝乳酶的C端區(qū)域中含有“Asp-Thr-Ser”模體，酵母菌凝乳酶的C端區(qū)域中也含有“Asp-Thr-Ser”模體，這與其他真菌源凝乳酶中含有的“Asp-Thr-Gly”模體不同[56-57]。

4 結(jié)論與展望

凝乳酶用途廣泛，目前對(duì)凝乳酶的需求越來(lái)越大，對(duì)凝乳酶的研究及開(kāi)發(fā)刻不容緩。微生物源凝乳酶研究，受到了廣泛的重視。微生物凝乳酶的研究基礎(chǔ)是獲得大量高產(chǎn)優(yōu)良凝乳酶的微生物菌株，雖然關(guān)于產(chǎn)凝乳酶微生物資源的研究已取得了一定的成果，但這方面的研究仍需進(jìn)一步加強(qiáng)和深化。將來(lái)產(chǎn)凝乳酶微生物的研究應(yīng)從以下幾方面進(jìn)一步深化。

（1）篩選更多優(yōu)良菌種，優(yōu)良菌株所產(chǎn)的凝乳酶應(yīng)凝乳活力高而水解活力低，易于生產(chǎn)，成本低，用其生產(chǎn)的干酪質(zhì)地和風(fēng)味易被消費(fèi)者接受。

（2）應(yīng)用誘變選育技術(shù)對(duì)產(chǎn)酶菌種進(jìn)行改良，提高單位產(chǎn)量，降低單位成本，使之更適于工業(yè)化生產(chǎn)。

（3）以現(xiàn)有的微生物凝乳酶基因資源為基礎(chǔ)，應(yīng)用基因工程技術(shù)提高其表達(dá)率，獲得更高的產(chǎn)量。

（4）以現(xiàn)有的微生物凝乳酶為基礎(chǔ)，應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)提高活性。

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Summary on rennet producing microorganisms

LI Xuepeng1,LIANG Qi1,SHI Xixiong1,FENG Ruizhang2,ZHANG Yan1,WEN Pengcheng1,ZHANG Weibing1*
(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China; 2.Key Laboratory of Fermentation Resources and Application at Universities of Sichuan Province,Yibin University,Yibin 644000,China)

Rennet is widely used in many aspects,it occurs in animal,plants and microorganisms.The variety of rennet-producing fungi,bacteria,actinomycetes,and the breeding situation of rennet producing microorganism were summarized,in order to provide reference for research and development of microbial rennet.

rennet;microorganisms;breeding

Q556

A

0254-5071（2014）04-0013-06

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.004

2014-03-14

發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（2011KFJ005）；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1308RJZA260）；十二五"農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011AA100903）

李學(xué)朋（1988-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠肺⑸铩?/p>

*通訊作者：張衛(wèi)兵（1974-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物。