許 華， 張 潔， 喻 靜

(1暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632；2太原市婦幼保健院藥劑科，山西 太原 030012；3廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東 廣州 510110)

·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

合成紅藻氨酸誘發(fā)大鼠癲癇作用的研究

許 華1△， 張 潔2， 喻 靜3

(1暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632；2太原市婦幼保健院藥劑科，山西 太原 030012；3廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東 廣州 510110)

目的觀察合成紅藻氨酸(SKA) 誘發(fā)大鼠癲癇的作用及其作用特點(diǎn)。方法Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、SKA 12 mg/kg、SKA 10 mg/kg 和 SKA 5 mg/kg 劑量組及紅藻氨酸 (KA)10 mg/kg陽(yáng)性對(duì)照組。腹腔注射給藥，連續(xù)8 h觀察大鼠癲癇發(fā)作的行為學(xué)變化及連續(xù)3.5 h記錄其腦電圖變化。結(jié)果合成紅藻氨酸5、10、12 mg/kg 腹腔注射，可誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作，其行為學(xué)及腦電改變與KA對(duì)照組無(wú)明顯差異。但合成紅藻氨酸誘發(fā)動(dòng)物癲癇呈現(xiàn)規(guī)律、穩(wěn)定及階段性明顯的特征，且大鼠的死亡率較天然紅藻氨酸低。結(jié)論合成紅藻氨酸腹腔注射可誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作，以10 mg/kg為較合適劑量。

合成紅藻氨酸； 模型，癲癇

紅藻氨酸(kainic acid， KA)是紅海藻海人草(Digeneasimplex)提取物，化學(xué)名為2-羧基-3羧甲基-4異丙烯基吡咯烷，與谷氨酸(glutamic acid,Glu)結(jié)構(gòu)相似，可作用于脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的Glu受體，既可直接興奮神經(jīng)元，又可增強(qiáng)鈉離子的通透性而使神經(jīng)細(xì)胞去極化，誘發(fā)癲癇的發(fā)生[1]。目前KA已作為癲癇急、慢性造模劑，廣泛應(yīng)用于癲癇的病理生理學(xué)研究及抗癲癇藥物篩選等研究中[2-5]。本文觀察了KA的人工合成品，即合成紅藻氨酸(synthetical kainic acid，SKA)是否具有誘發(fā)大鼠癲癇的作用，并觀察了其誘發(fā)癲癇的作用特點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1藥品

SKA由廣州諾東生物科技有限公司提供，白色針狀晶體，分子式：C10H15NO4·H2O。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)結(jié)果顯示，其分子量為231.2，純度大于99%，批號(hào)為nd000700312。臨用時(shí)用生理鹽水配制成所需濃度，按5 mL/kg BW腹腔注射給藥。對(duì)照品KA購(gòu)自Sigma，批號(hào)為086K1524，配制方法同SKA。

2動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar成年健康大鼠，雌雄各半，體重(192±22)g，購(gòu)于第一軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為0027687。大鼠自由飲食飲水，實(shí)驗(yàn)前在室溫(24±2)℃實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

3分組及劑量設(shè)計(jì)

已有大量用天然提取物紅藻氨酸誘發(fā)大鼠癲癇的研究報(bào)道，其對(duì)大鼠腹腔注射常用劑量為10 mg/kg[6-8]。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)SKA 12 mg/kg、10 mg/kg和5 mg/kg 3個(gè)劑量組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)設(shè)立KA(10 mg/kg)陽(yáng)性對(duì)照組和正常(生理鹽水)對(duì)照組。

4方法

4.1行為學(xué)觀察 大鼠40只，隨機(jī)分為5個(gè)組，每組8只，分別為正常對(duì)照組、SKA組高、中、低劑量組(分別為12 mg/kg、10 mg/kg、5 mg/kg)和KA陽(yáng)性對(duì)照組(劑量10 mg/kg)。均于上午9時(shí)左右腹腔注射給藥。用藥后觀察不同組別大鼠8 h內(nèi)癲癇發(fā)作情況如潛伏期、發(fā)作級(jí)別、發(fā)作持續(xù)時(shí)間、發(fā)作次數(shù)等行為學(xué)變化。行為學(xué)表現(xiàn)分級(jí)參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[9]：Ⅰ級(jí)：凝視等；Ⅱ級(jí)：I級(jí)+節(jié)律性點(diǎn)頭；Ⅲ級(jí)：II級(jí)+雙側(cè)前肢陣攣；Ⅳ級(jí)：III級(jí)+后肢站立；Ⅴ級(jí)：IV級(jí)+摔倒/四肢抽搐，并計(jì)數(shù)24 h內(nèi)各組動(dòng)物的死亡數(shù)。

4.2腦電圖觀察 另設(shè)24只大鼠，分為3組，即正常對(duì)照組、SKA 10 mg/kg組和KA 10 mg/kg組。乙醚麻醉大鼠，使其俯臥位固定于腦立體定位儀上，待其清醒約10 min后進(jìn)行腦電監(jiān)測(cè)。應(yīng)用BL-420腦電監(jiān)測(cè)系統(tǒng)對(duì)大鼠進(jìn)行腦電波記錄。采用頭皮電極，在大鼠雙側(cè)顳部頭皮處各插入1根針電極，參考電極插入鼻尖部，組成2個(gè)導(dǎo)聯(lián)：(1) T1：左顳葉-參考電極；(2) T2：右顳葉-參考電極[10]。準(zhǔn)備工作完畢后，先觀察5-10 min，待大鼠適應(yīng)腦立體定位儀并波形穩(wěn)定后開(kāi)始給藥并計(jì)時(shí)，連續(xù)3.5 h監(jiān)測(cè)腦電變化及相應(yīng)行為改變。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1SKA引起的大鼠癲癇樣發(fā)作行為學(xué)變化

腹腔注射10 mg/kg SKA后約5 min，大鼠出現(xiàn)凝視行為(Ⅰ級(jí))，繼之分別在約23 min、97 min、140 min和129 min動(dòng)物順序出現(xiàn)Ⅱ-Ⅴ級(jí)癲癇發(fā)作。約43 min后出現(xiàn)“濕狗樣” 抖身(WDS)。每次發(fā)作時(shí)間為2-10 s，發(fā)作間期動(dòng)物呈呆滯不動(dòng)或燥動(dòng)不安。反復(fù)發(fā)作3-4 h后動(dòng)物癥狀開(kāi)始減輕，7-8 h 發(fā)作基本停止，此后動(dòng)物呈衰竭狀態(tài)而呆滯不動(dòng)；14 h后基本恢復(fù)正常。其它劑量組動(dòng)物行為學(xué)改變?cè)斠?jiàn)表1-5。SKA(10 mg/kg)組死亡率為0，而同劑量KA組為37%。

表1SKA誘發(fā)癲癇發(fā)作不同級(jí)別的動(dòng)物數(shù)

GroupThegradesofepilepticseizure(n)ⅠⅡⅢⅣⅤNormalcontrol00000SKA(12mg/kg)8/88/88/88/88/8SKA(10mg/kg)8/88/88/84/81/8SKA(5mg/kg)5/55/55/50/50/5KA(10mg/kg)8/88/85/85/82/8

表2 SKA誘發(fā)癲癇發(fā)作不同級(jí)別潛伏期

*P<0.05vsKA (10 mg/kg) group;nsee table 1.

表3 SKA誘發(fā)癲癇發(fā)作不同階段的持續(xù)時(shí)間

The persistence time means the longest time at different grades.*P<0.05,**P<0.01vsKA (10 mg/kg) group;nsee table 1.

表4 SKA誘發(fā)癲癇發(fā)作不同級(jí)別特征性動(dòng)作的次數(shù)

The frequency of Ⅰ, Ⅱand Ⅲ grades means the total numbers which were recorded before the characteristic behaviors of next grade appeared. The frequency of Ⅳ or Ⅴ grade indicates the total number of the characteristic behaviors in Ⅰto Ⅴ grade.△P>0.05vsKA (10 mg/kg) group.nsee table 1.

表5各組大鼠濕狗樣抖動(dòng)(wet-dogshake)表現(xiàn)

GroupLatency(min)Persistencetime(min)TotalnumberMaximumnumberin1minNormalcontrol0000SKA(12mg/kg)43.38±8.4746.25±12.1722.13±7.383.50±1.41SKA(10mg/kg)44.75±11.83△58.14±27.20△23.88±12.86△5.00±2.98△SKA(5mg/kg)18.67±7.57136.67±90.7326.33±14.054.33±2.08KA(10mg/kg)42.40±2.3048.57±28.8024.00±8.944.60±0.89

△P>0.05vsKA (10 mg/kg) group.nsee table 1.

2SKA用藥后大鼠腦電的變化

正常大鼠腦電圖波幅低，大概在10 μV左右波動(dòng)，節(jié)律平穩(wěn)，頻率約110 Hz左右，見(jiàn)圖1。注藥后至癲癇發(fā)作時(shí)間段內(nèi)，腦電波形無(wú)明顯改變。當(dāng)大鼠出現(xiàn)抽搐等癲癇行為時(shí)，可見(jiàn)典型的高幅棘波(圖2)，但頻率改變不明顯。繼之出現(xiàn)尖波和尖慢疊加波，并可觀察到大鼠一些相伴行的行為表現(xiàn)，如豎尾(圖3)、劇烈甩尾(圖4)等。

討 論

KA由Murakami等于1953年從紅海藻中提取，最初主要用途為驅(qū)蟲(chóng)劑，后用于模擬腦退變的研究。但其價(jià)格可高達(dá)每10 mg 約200余美元，使得不少研究者不得已采用一些模擬腦退變效果并不顯著、但可以減少其研究費(fèi)用的其它造模劑。近年來(lái)一些藥學(xué)家開(kāi)始致力于紅藻氨酸的研制，如在具備海水的暖房?jī)?nèi)種植海藻然后生產(chǎn)紅藻氨酸，或仍以傳統(tǒng)的海人草作原料提取紅藻氨酸。本文研究了一種完全合成的紅藻氨酸誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作的作用。

1合成紅藻氨酸(SKA)所致大鼠癲癇急性發(fā)作特點(diǎn)

1.1癲癇階段性發(fā)作特征[11,12]I級(jí)發(fā)作：大鼠注射SKA后，均迅速出現(xiàn)呼吸急促、弓背、豎毛等狀態(tài)，約4 min大多動(dòng)物進(jìn)入抑制狀態(tài)，表現(xiàn)為靜伏少動(dòng)、眼神呆滯，此期內(nèi)可出現(xiàn)凝視(Ⅰ級(jí)特征)、眼裂變大、雙眼球突出及顏面肌輕微抽搐。II級(jí)發(fā)作：注射SKA后約23 min，在Ⅰ級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)節(jié)律性的點(diǎn)頭(Ⅱ級(jí)特征)，平均1.5次/秒；此期可見(jiàn)大鼠尾硬，甚或垂直豎起，發(fā)作完畢緩解變軟。Ⅲ級(jí)發(fā)作：注射SKA后約98 min，在Ⅱ級(jí)發(fā)作的基礎(chǔ)上，動(dòng)物出現(xiàn)雙側(cè)前肢陣攣(Ⅲ級(jí)特征)，完畢后動(dòng)物可正?；顒?dòng)一段時(shí)間后，再次發(fā)生陣攣，2-3次之后出現(xiàn)雙側(cè)前肢陣攣伴后肢站立(IV級(jí))狀態(tài)。IV級(jí)發(fā)作：注藥后1-3.5 h，動(dòng)物出現(xiàn)雙側(cè)前肢陣攣伴后肢站立(IV級(jí)特征)，可在較短時(shí)間內(nèi)連續(xù)出現(xiàn)；有時(shí)觀察不到單獨(dú)的III級(jí)，有時(shí)IV級(jí)在III級(jí)之前，III級(jí)IV級(jí)經(jīng)常交替出現(xiàn)，界限模糊。Ⅴ級(jí)發(fā)作：Ⅴ級(jí)是在Ⅳ級(jí)基礎(chǔ)上的大發(fā)作，可見(jiàn)大鼠后肢豎直立起，向一側(cè)或向后翻倒，或摔倒后快速爬起，有些則是摔倒后保持側(cè)臥并四肢抽搐，連續(xù)抽或僅抽動(dòng)1次。在Ⅳ級(jí)-Ⅴ級(jí)之前均伴有明顯的咀嚼和眨眼，甚至可聽(tīng)到牙齒碰擊的聲音，并大量流涎，或口吐白沫；眨眼狀態(tài)頻度甚快，甚至呈現(xiàn)似閉眼或半閉眼狀態(tài)，多為單只眼表現(xiàn)。閉眼與咀嚼同時(shí)進(jìn)行，是動(dòng)物進(jìn)入IV-V級(jí)的先兆。

Figure 1. Normal electroencephalogram in rats showed that the wave amplitude fluctuated at 10 μV and the frequency was 110 to 120 Hz.

圖1大鼠正常腦電圖

Figure 2. The rat’s electroencephalogram recorded at 96 min after SKA (10mg/kg) injection showed that the amplitude evidently increased. Meanwhile the rat had convulsion, corresponding to Ⅲ grade epileptic seizure.

圖2SKA10mg/kg注藥后96min腦電圖

Figure 3. The rat’s electroencephalogram recorded at 132 min after SKA (10mg/kg) injection showed that the fused-wave appeared. Meanwhile the rat’s tail reared, corresponding to IV grade epileptic seizure.

圖3SKA10mg/kg注藥后132min腦電圖

Figure 4. The rat’s electroencephalogram recorded at 137 min after SKA (10mg/kg) injection showed that many independent waves were confluent. Meanwhile the rat was gravis tail-flicked,corresponding to V grade epileptic seizure.

圖4SKA10mg/kg注藥后137min大鼠腦電圖

1.2癲癇發(fā)作的某些特殊行為 (1)轉(zhuǎn)圈行為和扭身動(dòng)作：大鼠在近Ⅲ級(jí)發(fā)作之前，在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級(jí)發(fā)作間期和V級(jí)發(fā)作之后的緩解期，會(huì)出現(xiàn)以尾部為中心或以一定半徑朝同一方向進(jìn)行的轉(zhuǎn)圈行為，時(shí)快時(shí)慢，多持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。另外，尚可見(jiàn)動(dòng)物出現(xiàn)扭身動(dòng)作-大鼠保持臀部坐立姿勢(shì)，頭向后下扭向尾根，甚或吸咬尾根，有時(shí)身體扭曲過(guò)度進(jìn)而摔倒。(2)拍擊地面、身體挪移或弓背倒退行走：除經(jīng)典的Ⅳ級(jí)、Ⅴ級(jí)癥狀外，在Ⅲ級(jí)發(fā)作之后動(dòng)物還會(huì)出現(xiàn)如下幾種狀態(tài)：a、雙前肢或四肢同時(shí)拍擊地面。如是四肢同時(shí)拍擊，動(dòng)物趴位并弓背，似輕微蹦起。b、大鼠坐位，雙前肢向前推地身體向后頓挫性挪移。c、動(dòng)物弓背低頭倒退行走。(3)其它癥狀：有些動(dòng)物雖沒(méi)有出現(xiàn)典型的Ⅳ、Ⅴ級(jí)癥狀，但出現(xiàn)身體豎立、向上劇烈竄跳，跳起時(shí)左右亂撞，力度大、發(fā)作猛，跳躍完畢后大鼠摔落癱軟在地，這也是大發(fā)作的一種表現(xiàn)，可歸為大發(fā)作。值得注意的是本實(shí)驗(yàn)中“濕狗樣”抖動(dòng)(WDS)這一癲癇經(jīng)典動(dòng)作是在看到明顯的節(jié)律性點(diǎn)頭(Ⅱ級(jí))之后才出現(xiàn)的，緊接著才是Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級(jí)的連續(xù)發(fā)作，并且WDS動(dòng)作持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，發(fā)作頻繁，并非像使用天然提取KA造模的大量文獻(xiàn)所述，即WDS是癲癇發(fā)作的前驅(qū)動(dòng)作，甚至有些分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將其歸入Ⅰ級(jí)，與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果不相符。

大發(fā)作完畢后，大鼠癱軟在地，時(shí)間長(zhǎng)短不一，少數(shù)動(dòng)物在8 h內(nèi)可恢復(fù)正常，大部分則不能，個(gè)別動(dòng)物一直處于轉(zhuǎn)圈狀態(tài)。只能誘發(fā)到Ⅲ級(jí)發(fā)作的大鼠在Ⅲ級(jí)發(fā)作后表現(xiàn)為頻繁的搓臉洗澡動(dòng)作，或采用直立坐姿，頭部低垂，雙前肢有節(jié)律的揉搓下腹部。8 h內(nèi)死亡的大鼠，在死亡之前都會(huì)出現(xiàn)1次大發(fā)作，以身體縱軸為軸線，從地面旋轉(zhuǎn)著向空中上升，大約離地1-3 cm高度短暫停留空中，旋轉(zhuǎn)1或者2圈后落下，此時(shí)動(dòng)物已近死亡狀態(tài)。檢查死亡大鼠，有些可見(jiàn)口鼻部有血沫，或前后肢指趾有血跡或出現(xiàn)血淚癥。

2SKA所致大鼠癲癇腦電圖及其特點(diǎn)

發(fā)生特征性癲癇行為同時(shí)的腦電圖均可見(jiàn)若干個(gè)獨(dú)立波形合并，有些甚至偏離基線，波形極不規(guī)則。待癲癇緩解時(shí)，此特殊波形消失，并迅速恢復(fù)正常波形。SKA與KA相應(yīng)時(shí)間段腦電波形相似。由于大鼠固定于腦立體定位儀上，判斷其是否進(jìn)入典型癲癇狀態(tài)最可靠易行的方法是觀察大鼠的尾部變化。發(fā)作初期，大鼠尾僵硬，似棍狀，隨后垂直豎起，以尾根部為圓心垂直于身體做圓周動(dòng)作，即“甩尾”，幾乎出現(xiàn)在整個(gè)發(fā)作期，僅速度和尾硬程度不同。在發(fā)作前或發(fā)作過(guò)后緩解期，幾分鐘到十幾分鐘不等發(fā)生1次甩尾動(dòng)作，緩慢旋轉(zhuǎn)。偶見(jiàn)抽搐，但并未觀察到單獨(dú)的肢體陣攣。在整個(gè)發(fā)作期可見(jiàn)大鼠背毛豎起。在出現(xiàn)上述行為表現(xiàn)時(shí)，大鼠腦電波形并未呈現(xiàn)明顯規(guī)律性變化，其頻率和正常狀態(tài)無(wú)明顯差異，但波幅大多明顯增高。

總之，合成紅藻氨酸誘發(fā)大鼠癲癇作用的結(jié)果顯示，SKA 5-12 mg/kg腹腔注射可誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作，以10 mg/kg劑量為佳。其誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作的行為學(xué)特征及腦電改變與天然紅藻氨酸對(duì)照組無(wú)明顯差異，但合成紅藻氨酸誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作的階段性明顯、行為學(xué)表現(xiàn)規(guī)律、穩(wěn)定，死亡率亦較低，原因可能與其純度較高有關(guān)。

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Synthetickainateacidinducesseizuresinrats

XU Hua1, ZHANG Jie2, YU Jing3

(1PharmacyCollegeofJinanUniversity,Guangzhou510632,China;2MaternalandChildHealthHospitalofTaiyuan,Taiyuan030012,China;3GuangzhouQualitySupervisionandTestingInstitute,Guangzhou510110,China.E-mail:huax-mail@163.com)

AIM: To observe the effect of synthetical kainic acid (SKA) on inducing epileptic seizure in rats.METHODSForty Wistar rats were divided into normal control group, 5 mg/kg, 10 mg/kg and 12 mg/kg SKA-treated groups and kainic acid (KA) positive control group. The SKA was injected intraperitoneally. The changes of the epileptic behaviors were observed for 8 h successively and the electroencephalography was recorded for 3.5 h.RESULTSSKA induced epileptic seizures at the dose of 5-12 mg/kg by intraperitoneal injection. No apparently difference between SKA and KA on the changes of epileptic behaviors or electroencephalography was observed. However, the epileptic seizure induced by SKA showed obvious stages, regular pattern and action steady. In addition, SKA caused lower fatality than KA did.CONCLUSIONSKA induces epileptic seizure in rats and the dose of 10 mg/kg by intraperitoneal injection is the optimal.

Synthetic kainate acid; Models,epilepsy

R742.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.041

1000-4718(2011)01-0204-05

2010-07-28

2010-10-19

△通訊作者 Tel: 020-85224766; E-mail:huax-mail@163.com