唐孝鵬，蘇 敏，張玉良，肖 敏

(嘉吉烯王生物工程(武漢)有限公司，湖北武漢 420223)

油脂中花生四烯酸含量測定

唐孝鵬，蘇 敏，張玉良，肖 敏

(嘉吉烯王生物工程(武漢)有限公司，湖北武漢 420223)

建立了一種對油脂中花生四烯酸含量的檢測方法，在加入內(nèi)標的基礎(chǔ)上，使用氫氧化鉀－甲醇溶液甲酯化，生成的脂肪酸甲酯使用DB－23毛細管柱進行分離檢測，結(jié)果采用內(nèi)標法進行分析。結(jié)果表明:該方法的回收率在99.58%，儀器精密度RSD為0.45%，方法精密度RSD 0.85%，方法重現(xiàn)性RSD 0.74%。本方法能準確、有效地對油脂中的花生四烯酸含量進行檢測，能滿足實際檢測工作的需要。

內(nèi)標法，花生四烯酸，氣相色譜法

花生四烯酸屬n－6系列長鏈多不飽和脂肪酸，研究表明，ARA在血液、肝臟、肌肉和其他器官系統(tǒng)中作為與磷脂結(jié)合的結(jié)構(gòu)脂類起著重要的作用。作為人體必需脂肪酸，是細胞膜的組成成份，是大腦和神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及皮膚必不可少的物質(zhì)［1］。它具有其他物質(zhì)所不具備的生命體必需的生物活性，特別對嬰幼兒智力發(fā)育和視網(wǎng)膜都有極好的作用［2］。另外的研究表明，ARA還具有很多重要的保健功能，如益智健腦、提高視敏度、酯化膽固醇、增加血管彈性、降低血液黏度、調(diào)節(jié)血細胞功能、調(diào)節(jié)血脂和血糖、抗炎癥等作用［3］。油脂中脂肪酸含量的檢測方法主要是氣相色譜法。脂肪酸的極性較強，因此需要將脂肪酸衍生成脂肪酸甲酯進行分析，以得到更為可靠和重復性的數(shù)據(jù)。常用的方法有三氟化硼法、三甲基氫氧化硫法、酯交換法等［4－6］，本文使用氫氧化鉀甲醇法對油脂進行甲酯化處理，并使用內(nèi)標法進行檢測研究，計算花生四烯酸的含量，此法具有操作簡便、快速，重現(xiàn)性好等優(yōu)點。通過實驗證明，它是花生四烯酸含量測定的一種較理想的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生四烯酸油脂 嘉吉烯王生物工程(武漢)有限公司產(chǎn)品;花生四烯酸(ARA)甘油三酯、十三碳烷酸甘油三酯標準品 NU－CHEK公司;正庚烷 色譜純;石油醚 沸程，30～60℃;氫氧化鉀甲醇溶液(4mol/L)、花生四烯酸甘油三酯儲備液(10mg/mL)、十三碳烷酸甘油三酯儲備液(10mg/mL)。

Agilent6850氣相色譜儀(火焰離子化檢測器)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 稱取0.04g試樣(精確至0.0001g)置于10mL容量瓶中，加入2.0mL十三碳烷酸甘油三酯內(nèi)標儲備液，加入適量正庚烷使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。準確吸取2mL正庚烷溶解液置于10mL帶蓋離心管中，加入0.2mL氫氧化鉀－甲醇溶液，劇烈振蕩1min以上，放置10min(甲基化反應)。如有機層渾濁，可離心使之澄清。取上清液進行氣相色譜檢測，進樣量1μL。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:DB－23毛細管柱(30m× 250μm×0.25μm);檢測器為FID，溫度300℃;柱溫采用程序升溫:90℃保持1min，以9℃/min升溫到240℃保持5min，然后以3℃/min升溫到250℃;檢測器溫度為300℃;載氣為N2，氫氣流速30mL/min，空氣流速200mL/min;載氣流速1.33mL/min;尾吹流量50mL/min。

1.2.3 標準溶液的配制 分別吸取適量的花生四烯酸儲備液置于10mL的容量瓶中，并在每瓶中加入2mL的十三碳烷酸儲備液，稀釋定容使其花生四烯酸甘油三酯濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0mg/mL，十三碳烷酸甘油三酯濃度為2.0mg/mL的標準液，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲酯化時間的選擇

反應時間是影響甲酯化程度的一個重要因素，時間太短，甲酯化反應不夠完全;時間太長，則影響了實驗效率。因此本實驗對不同時間下的響應值進行了比較，其結(jié)果見表1。

表1 不同甲酯化時間的響應值

從表1可以看出，當甲酯化的時間增加到1min后，響應值出現(xiàn)波動，之后延長時間沒有明顯的變化趨勢，因此本實驗選擇甲酯化時間為不小于1min振搖時間。

2.2 氫氧化鉀甲醇濃度的選擇

氫氧化鉀甲醇的濃度是影響甲酯化程度的另一個重要因素，本實驗對不同濃度的氫氧化鉀甲醇溶液進行了比較，結(jié)果見表2。

表2 加入不同濃度的氫氧化鉀甲醇溶液時的響應值

從表2可以看出，選用4.0mol/L的氫氧化鉀甲醇溶液時，甲酯化反應的效果最好，因此本實驗選擇氫氧化鉀－甲醇溶液的濃度為4.0mol/L。

2.3 繪制標準曲線

分別吸取2mL標準液，置于10mL帶蓋離心管中，加入0.2mL氫氧化鉀－甲醇溶液，劇烈振蕩1min以上，放置10min，取1μL上清液進樣。每一濃度進樣三次，以標準工作溶液中花生四烯酸甘油三酯的濃度(mg/mL)為橫坐標，以花生四烯酸/十三碳烷酸的峰面積比為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 花生四烯酸含量檢測標準曲線

2.4 方法的準確度

分別稱取0.1011g菜籽色拉油(1#)，1mL 10mg/mL花生四烯酸甘油三酯標準品(2#)，0.1314g菜籽色拉油加入5mL 10mg/mL花生四烯酸粉劑標準品(3#)，按1.2.1進行甲酯化操作，取上清液1μL，分別進樣檢測。

2#瓶ARA標品甲酯化后出峰時間17.956min;1#瓶色拉油甲酯化后在此附近的峰出峰時間分別有17.087min以及18.426min，離17.956min均較遠，可判斷此色拉油中無花生四烯酸成分。3#瓶色譜分析可得C13甲酯峰面積630.18132pA·s;ARA甲酯峰面積825.63816pA·s，由此可求得ARA脂肪酸質(zhì)量m=0.04559g。加入色拉油中的 ARA乙酯質(zhì)量為0.05g，轉(zhuǎn)換成ARA脂肪酸的質(zhì)量為0.05g×(304/ 332)=0.04578g，方法準確度可用回收率表示為99.58%。

2.5 方法的精密度2.5.1 儀器精密度 分別取2mL花生四烯酸、十三碳烷酸儲備液，定容于10mL的容量瓶中，按1.2.1方法甲酯化。色譜分析，進樣量1μL，重復六次。結(jié)果見表3。

表3 儀器精密度驗證數(shù)據(jù)

從表3可以看出，對同一樣品多次檢測，十三碳烷酸/花生四烯酸響應值比的變異系數(shù)(RSD)為0.45%。

2.5.2 方法精密度 取3個25mL容量瓶，稱取適量花生四烯酸油脂，按1.2.1處理后進行色譜分析，進樣量為1μL。根據(jù)RSD評價花生四烯酸油脂含量分析方法實驗的精密度。此實驗重復三次，分三個工作日進行。結(jié)果如表4所示。

從表4中可以看出，對同一樣品在不同時間內(nèi)檢測值的RSD為0.85%，小于2%。本方法精密度符合要求。

2.5.3 方法重現(xiàn)性 在“方法精密度驗證”中，實驗員A對ARA油劑按照1.2.1方法處理，得到的平均ARA%為40.66%。以下是另三名實驗員在不同工作日對同一瓶樣品按照1.2.1方法進行處理得到的數(shù)據(jù)。可根據(jù)RSD評價不同實驗者的精密度。結(jié)果如表5所示。

從表5中可以看出，對同一樣品在不同人員操作分析檢測值的RSD為0.74%，小于2%。本方法精密度符合要求。

3 結(jié)論

使用本方法測定油脂中花生四烯酸的含量，回收率為99.58%，儀器精密度(RSD)為0.45%，方法精密度(RSD)0.85%，不同實驗者精密度(RSD) 0.74%。實驗結(jié)果表明，該方法準確，重現(xiàn)性好，簡便易行，可用于油脂中常規(guī)ARA含量的檢測。

表4 方法精密度驗證數(shù)據(jù)

表5 方法重現(xiàn)性驗證結(jié)果

［1］Singh G，Chandra R K.Biochemical and cellular efects of fish and fish oils［J］.Prog Food Nutr，1988，12:371－419.

［2］Evans C T，Ratledge C.Effect of nitrogen source on lipid accumulateion in oleaginous yeasts［J］.Journal of General Microbiology，1993，130:1693－1704.

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［4］可成有，吳曉芳.不飽和脂肪酸的氣相色譜法同時測定［J］.中國衛(wèi)生檢疫雜志，2005，15(5):528－535.

［5］馬文宏，張燕，薛剛，等.二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸(AA)在嬰幼兒配方奶粉中的測定［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28(8):142－144.

［6］李麗娜，湯華成，于長青.深黃被孢霉高產(chǎn)花生四烯酸菌株的微波誘變育種［J］.食品與生物技術(shù)學報，2009，28(1): 117－121.

Determination of the arachidonic acid in oil

TANG Xiao－peng，SU Min，ZHANG Yu－liang，XIAO Min
(Cargill Alking Bioengineering(Wuhan)Co.，Ltd.，Wuhan 420223，China)

Based on adding internal label，a method for determination of ARA oil had been established，the sample was methanol etherified by potassium hydroxide mixed with methyl hydrate，and then the methyl ester of aliphatic acid was separated by DB－23 capillary column.The results were:ARA recovery percent was 99.58%.The relative standard deviation(RSD)of precision of instrument and method was 0.45%and 0.85%，respectively.The relative standard deviation(RSD)of repeatability of method was 0.74%.This method was accurate and efficient for detecting ARA content and can meet reality demand.

internal standard method;arachidonic acid;gas chromatography

TS207.3

A

1002－0306(2011)12－0465－03

2011－09－06

唐孝鵬(1976－)，男，本科，從事油脂方向的研究工作。