管 驍，農(nóng)衛(wèi)良，曹 慧，姚 遠(yuǎn)

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

熒光光度法快速定量大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)方法研究

管 驍，農(nóng)衛(wèi)良，曹 慧，姚 遠(yuǎn)

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

研究比較了菌體滲透處理方式與培養(yǎng)方式對(duì)大腸桿菌熒光光度法檢測(cè)效果的影響，以及考察了培養(yǎng)條件對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明僅采用滲透處理方式處理菌液會(huì)造成熒光檢測(cè)值偏小，靈敏度偏低;但經(jīng)LST－MUG(pH7.0)培養(yǎng)液44℃培養(yǎng)7h后的熒光值能對(duì)100.9～106.8cells/mL范圍內(nèi)的大腸桿菌進(jìn)行定量，結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法無顯著性差異。該法進(jìn)一步縮短了大腸桿菌的檢測(cè)時(shí)間至8h左右，且重現(xiàn)性良好，適合于大腸桿菌的定量檢測(cè)。

大腸桿菌，快速檢測(cè)，熒光光度法

大腸桿菌是國(guó)際公認(rèn)的環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測(cè)和食品安全中的重要指示菌，世界各國(guó)也普遍將大腸桿菌作為公共衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)和食品安全領(lǐng)域中強(qiáng)制性的檢測(cè)內(nèi)容［1］。目前大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)定量檢測(cè)方法主要以多管發(fā)酵法和濾膜法為主，這兩種方法均存在操作繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)等不足，很難適應(yīng)公共衛(wèi)生、食品安全事件應(yīng)急處理與快速反應(yīng)的需要［2］?；诖竽c桿菌細(xì)胞內(nèi)存在特異性β－D－葡糖醛酸糖苷酶(β－D－glucuronidase，GUS)，并能分解4－甲基傘形酮β－D－葡萄糖苷酸(4－Methylumbelliferyl－β－DGlucuronide，MUG)進(jìn)而產(chǎn)生熒光產(chǎn)物這一原理，國(guó)外已成功建立了環(huán)境、食品、水體和臨床標(biāo)本中大腸桿菌的MUG快速檢測(cè)方法，并將其作為檢測(cè)大腸桿菌的主要方法之一［3－4］。MUG 快速檢測(cè)法可將傳統(tǒng)方法6～10d的檢測(cè)時(shí)間縮短至16～18h以內(nèi)，并具有特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［4］，然而該方法仍存在一些缺陷，如18h左右的檢測(cè)時(shí)間仍偏長(zhǎng)，檢測(cè)限仍有待提高等。為進(jìn)一步推廣該方法的應(yīng)用，以上缺陷亟需改進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)擬從提高GUS的生成釋放量及酶解底物效率兩個(gè)角度出發(fā)，分別研究在菌體滲透條件與培養(yǎng)條件下大腸桿菌的熒光檢測(cè)結(jié)果，以及培養(yǎng)條件對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，為進(jìn)一步縮短大腸桿菌熒光定量檢測(cè)時(shí)間，降低檢測(cè)限進(jìn)行一些探索性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ACTT－8099) 由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所提供;4－甲基傘形酮(MU)、4－甲基傘形酮－β－D－葡萄糖醛酸苷(MUG) 購(gòu)自Sigma公司;曲拉通X－100 購(gòu)自Farco公司。

VersaFluor熒光分光光度計(jì) 美國(guó) bio－rad;TOMY SS－325高溫蒸汽滅菌鍋;JY92－Ⅱ超聲波細(xì)胞破碎儀;熒光分光光度計(jì) 970CRT;PHSJ－4A pH計(jì)。

1.2 試劑及培養(yǎng)基配制

MUG溶液:取50mg MUG溶于50m L已滅菌的0.05mol/L PBS緩沖液中(pH=6.5)，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

月桂基硫酸鹽胰蛋白肉湯－MUG(LST－MUG)培養(yǎng)液:32g LST培養(yǎng)基溶于1000m L雙蒸水，121℃滅菌15m in。冷卻后，取1mg/m L MUG溶液25m L加入200m L上述培養(yǎng)基中制得LST－MUG培養(yǎng)基。

脫氧膽酸鈉－MUG(DOC－MUG)培養(yǎng)液:分別稱取胰蛋白胨4.0g，酵母膏3.0g，氯化鈉5.0g，十二烷基硫酸鈉0.1g，脫氧膽酸鈉1.0g，加蒸餾水至1000m L，充分溶解后調(diào)pH至7.8，121℃滅菌15min。冷卻后，取1mg/m L MUG溶液25m L加入200m L上述培養(yǎng)基中制得DOC－MUG培養(yǎng)基。

麥康凱培養(yǎng)液:胰蛋白胨20.0g，乳糖10g，氯化鈉5.0g，1%結(jié)晶紫0.1m L，溶于1000m L雙蒸水，調(diào)pH至7.4，121℃滅菌15m in。冷卻后，加入1%中性紅溶液3～4m L。取1mg/m L MUG溶液25m L加入200m L上述培養(yǎng)基中制得麥康凱－MUG培養(yǎng)基。

LB－MUG培養(yǎng)液:胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，氯化鈉 10.0g，溶于 1000m L雙蒸水，調(diào) pH至 7.0，121℃滅菌15m in。冷卻后，取1mg/m L MUG溶液25m L加入200m L上述培養(yǎng)基中制得LB－MUG培養(yǎng)基。

菌懸液的制備:將大腸桿菌保存菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)18h，用生理鹽水稀釋制成不同濃度菌懸液待用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大腸桿菌產(chǎn)生熒光光譜分析 將大腸桿菌菌液接入LST－MUG培養(yǎng)液中，同時(shí)將不接菌的培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，然后置于37℃水浴中恒溫培養(yǎng)7h后，用970CRT型熒光分光光度計(jì)掃描熒光光譜。另將0.375mg/L 4－甲基傘形酮(MU)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行熒光掃描以供光譜比對(duì)用。

1.3.2 菌體細(xì)胞滲透處理?xiàng)l件下熒光光度法檢測(cè)大腸桿菌 為加快釋放大腸桿菌內(nèi)源性GUS進(jìn)而酶解底物MUG產(chǎn)生熒光，可對(duì)菌體進(jìn)行滲透處理，包括選用機(jī)械裂解(超聲方法等)［7］和化學(xué)裂解(曲拉通X－100等)［8］等方法破壞細(xì)胞膜，促使大腸桿菌內(nèi)容物釋放。

1.3.2.1 超聲法處理對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 取大腸桿菌懸液(約106cells/m L)用超聲細(xì)胞破碎儀對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行破碎。破碎在冰浴環(huán)境中進(jìn)行，超聲程序?yàn)?200W工作30s，然后間隙60s，共進(jìn)行8次。取兩份(每份1m L)上述超聲處理過的菌懸液，各加入8m L PBS緩沖液(pH=6.5)與1m L MUG溶液，44℃分別保溫10、20m in，用NaOH調(diào)節(jié)pH至10.0。以不接菌種的空白溶液作參比，熒光分光光度計(jì)激發(fā)波長(zhǎng)355nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm處進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2.2 曲拉通X－100處理對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 取兩份1m L大腸桿菌菌懸液(約106cells/m L)，各加入8m L PBS與1m L MUG溶液，并添加0.1m L曲拉通X－100使最終曲拉通濃度為1%，混勻后在44℃分別保溫10、20m in調(diào)pH至10.0，測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.3.2.3 超聲結(jié)合曲拉通X－100處理對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 取兩份1m L超聲處理過的菌懸液(約106cells/m L)，各加入8m L PBS與1m L MUG溶液，再添加0.1m L曲拉通X－100使最終曲拉通濃度為1%，混勻后在44℃分別保溫10、20min調(diào)pH至10.0，測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.3.3 菌體培養(yǎng)條件下熒光光度法檢測(cè)大腸桿菌

1.3.3.1 不同培養(yǎng)條件對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

a.不同培養(yǎng)基對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 將大腸桿菌菌懸液(1.0×104cells/m L)分別接入DOC－MUG培養(yǎng)液、麥康凱－MUG培養(yǎng)液、LB－MUG培養(yǎng)液和LSTMUG培養(yǎng)液中，同時(shí)將對(duì)應(yīng)的不接菌培養(yǎng)液作空白對(duì)照，置于37℃恒溫培養(yǎng)，每隔1h測(cè)其熒光強(qiáng)度。

b.培養(yǎng)液pH對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 將大腸桿菌菌懸液接入不同 pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的LST－MUG培養(yǎng)液中，44℃培養(yǎng)，7h后測(cè)定培養(yǎng)液的熒光強(qiáng)度。

在另一組實(shí)驗(yàn)中，將大腸桿菌菌懸液接入LSTMUG培養(yǎng)液中，44℃培養(yǎng)7h后，再將培養(yǎng)液的pH調(diào)至 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 后測(cè)定熒光強(qiáng)度。

c.培養(yǎng)溫度及時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 將大腸桿菌菌懸液接入LST－MUG培養(yǎng)液中，分別置于33、37、40、44、48℃恒溫培養(yǎng)1、3、5、7 和9h 后，將培養(yǎng)液pH調(diào)至10.0后，測(cè)定培養(yǎng)液熒光強(qiáng)度。

1.3.3.2 菌體培養(yǎng)結(jié)合細(xì)胞滲透處理對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 將1m L約104cells/m L濃度的大腸桿菌菌懸液接入9m L LST－MUG培養(yǎng)基中，37℃水浴培養(yǎng)7h后，再按1.3.2中步驟分別進(jìn)行超聲處理、曲拉通X－100處理以及超聲結(jié)合曲拉通X－100處理，將不接菌的LST－MUG培養(yǎng)液作為空白對(duì)照檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.3.4 大腸桿菌接種量與熒光強(qiáng)度的關(guān)系 將不同濃度(100～105cells/m L)的大腸桿菌接種于 LSTMUG培養(yǎng)液中(pH7.0～7.2)，44℃培養(yǎng)7h后加入NaOH調(diào)pH至10左右，測(cè)定熒光強(qiáng)度。同時(shí)將對(duì)應(yīng)的菌懸液采用最大可能數(shù)法(GB/T4789.38－2008)進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制大腸桿菌總數(shù)與熒光強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 確證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)所選定的檢測(cè)條件，檢測(cè)3份未知濃度的大腸桿菌菌懸液的熒光強(qiáng)度，利用計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，每份樣品平行測(cè)定5次。同時(shí)采用最大可能數(shù)法進(jìn)行定量，驗(yàn)證熒光光度法的準(zhǔn)確性。數(shù)據(jù)分析采用STATISTIC 18.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體細(xì)胞滲透處理?xiàng)l件下與菌體培養(yǎng)條件下熒光光度法檢測(cè)大腸桿菌的對(duì)比

MUG本身無熒光特性，但其酶解產(chǎn)物MU是一種熒光物質(zhì)，用紫外燈照射可產(chǎn)生熒光［5］。本實(shí)驗(yàn)中MU標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)熒光掃描，證明激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別在325及450nm左右;大腸桿菌的LST－MUG培養(yǎng)液經(jīng)熒光掃描也發(fā)現(xiàn)有熒光產(chǎn)生(激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為355及455nm)，但大腸桿菌菌懸液和不接菌的MUG培養(yǎng)液無任何熒光，這說明大腸桿菌在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的酶能分解MUG并產(chǎn)生MU，這是熒光法定量大腸桿菌的理論基礎(chǔ)。其中激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)生紅移現(xiàn)象可能是由培養(yǎng)液自身顏色、菌體濁度及其他因素干擾造成的。因此后面的實(shí)驗(yàn)將確定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為355和450nm。

超聲波具有空化效應(yīng)，曲拉通X－100則是一種非離子表面活性劑兼熒光增敏劑，這兩種方式均能有效破壞生物膜，從而促使細(xì)胞內(nèi)容物的釋放［6－7］。由圖1結(jié)果可知，未進(jìn)行任何處理的大腸桿菌液與MUG共孵育，在20m in內(nèi)未見明顯熒光;但經(jīng)超聲法或曲拉通X－100等處理后熒光明顯，結(jié)果如圖1所示，證實(shí)了這兩種處理都可使大腸桿菌釋放出內(nèi)源性β－D－葡萄糖醛酸酶并分解MUG而產(chǎn)生熒光物質(zhì)。若超聲法與曲拉通同時(shí)使用，比單獨(dú)使用任一方式的熒光值均略有升高。雖然通過這兩種菌體滲透處理方式能檢測(cè)到熒光，并很大程度上縮短了檢測(cè)時(shí)間(0.5h內(nèi)就可檢出)，但總體而言檢測(cè)效果并不理想，檢測(cè)到的熒光值均偏小(低于700)，且測(cè)定過程中發(fā)現(xiàn)熒光不穩(wěn)定，測(cè)定誤差較大，這可能是由于菌液中大腸桿菌量少，產(chǎn)生的GUS過少且活性不高造成的。

圖1 不同處理?xiàng)l件下的大腸桿菌熒光檢測(cè)結(jié)果

為進(jìn)一步增大熒光強(qiáng)度，減小誤差，對(duì)大腸桿菌在LST－MUG中進(jìn)行了7h的培養(yǎng)后檢測(cè)熒光值，結(jié)果如圖1所示，培養(yǎng)液的熒光強(qiáng)度比不培養(yǎng)顯著增強(qiáng)，由此說明大腸桿菌在培養(yǎng)期間有大量的GUS產(chǎn)生，并能從菌體中釋放出來且活性較高。但在培養(yǎng)基礎(chǔ)上再進(jìn)行超聲破碎、添加曲拉通等處理與培養(yǎng)后直接檢測(cè)熒光強(qiáng)度差異不顯著(最大偏差4.29%)，這說明在菌體培養(yǎng)期間GUS已大量釋放，進(jìn)一步使用超聲破碎、添加曲拉通等處理對(duì)促進(jìn)GUS的釋放沒有明顯效果，而且培養(yǎng)結(jié)合超聲處理的熒光值比培養(yǎng)后直接檢測(cè)的還低，由此說明超聲、曲拉通等可能會(huì)造成酶的失活以及影響熒光檢測(cè)等，所以下一步的實(shí)驗(yàn)采用菌體培養(yǎng)后直接檢測(cè)的方法進(jìn)行，此方法比菌體滲透處理方式更為靈敏，有利于檢測(cè)限的降低。

2.2 培養(yǎng)條件對(duì)熒光檢測(cè)的影響

2.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)及熒光強(qiáng)度的影響 考察了四種不同培養(yǎng)液(DOC培養(yǎng)液、麥康凱培養(yǎng)液、LB培養(yǎng)液和LST培養(yǎng)液)分別培養(yǎng)大腸桿菌對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出培養(yǎng)基的選擇對(duì)熒光強(qiáng)度有很大影響，培養(yǎng)3h后LST培養(yǎng)液熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，DOC培養(yǎng)液和LB培養(yǎng)液也有所增加，但麥康凱培養(yǎng)液幾乎沒有增長(zhǎng);培養(yǎng)5h后LST培養(yǎng)液的熒光強(qiáng)度接近一個(gè)高值，進(jìn)一步延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間熒光強(qiáng)度不再增加，DOC培養(yǎng)液和LB培養(yǎng)液熒光值在5h后也漸趨穩(wěn)定。在培養(yǎng)5h時(shí)對(duì)四種培養(yǎng)液中的大腸桿菌數(shù)進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)LST培養(yǎng)液中菌數(shù)達(dá)到約4×107cells/m L，其次是DOC培養(yǎng)液(約7×106cells/m L)，麥康凱培養(yǎng)液中菌數(shù)(約1.2×106cells/m L)甚至比LB培養(yǎng)液中還大(0.8×106cells/m L)。根據(jù)大腸桿菌的生長(zhǎng)結(jié)果與熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)，說明在不同培養(yǎng)基條件下熒光強(qiáng)度并非和大腸桿菌數(shù)量呈嚴(yán)格的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，同時(shí)還會(huì)受其他因素的干擾。如麥康凱培養(yǎng)液盡管對(duì)大腸桿菌5h的增殖效果比LB培養(yǎng)液更理想，但反映出的熒光強(qiáng)度反而較小，可能是由于麥康凱培養(yǎng)基中的一些成分抑制β－D－葡萄糖醛酸酶的產(chǎn)生與釋放［8］，而大腸桿菌在LST培養(yǎng)液中生長(zhǎng)最好，且熒光強(qiáng)度也明顯強(qiáng)于其他幾種培養(yǎng)基，是一種理想的熒光檢測(cè)用培養(yǎng)液。

圖2 不同培養(yǎng)基對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

2.2.2 培養(yǎng)基pH對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 采用不同pH的LST－MUG培養(yǎng)液培養(yǎng)大腸桿菌后檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖3所示。從圖中可看出，pH低于7時(shí)隨pH的升高熒光強(qiáng)度明顯增加，在pH7.0左右熒光強(qiáng)度最高，進(jìn)一步提高pH熒光強(qiáng)度又急劇降低，這是由于不適當(dāng)?shù)膒H會(huì)顯著抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，并影響GUS的產(chǎn)生;另外，GUS的最適pH在6.5左右［8］，pH過高或過低會(huì)降低酶的活性，甚至失活。

圖3 不同pH條件下培養(yǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

大腸桿菌接種到LST－MUG培養(yǎng)液(pH7.0)中培養(yǎng)7h后再調(diào)整到不同的pH進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。從圖4中可看出，培養(yǎng)液的熒光強(qiáng)度在pH為5～10范圍內(nèi)明顯發(fā)生變化，隨著pH的增加而上升;當(dāng)pH＞10時(shí)，熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。由此可知熒光產(chǎn)物MU在堿性條件下有較強(qiáng)熒光，因此菌體培養(yǎng)結(jié)束后可通過提高培養(yǎng)液的pH來增強(qiáng)熒光強(qiáng)度，進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度，這與Maddocks［8］等人的研究結(jié)果類似。由此可見，采用pH為7.0的LST培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，待培養(yǎng)結(jié)束后，再調(diào)整pH至10進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)是較好的操作條件。

圖4 pH對(duì)熒光強(qiáng)度測(cè)定的影響

2.2.3 培養(yǎng)溫度及時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 大腸桿菌的生長(zhǎng)溫度為10～45℃，最適溫度為37℃［9］。大腸桿菌在LST－MUG培養(yǎng)液中進(jìn)行不同溫度的培養(yǎng)，熒光強(qiáng)度變化如圖5所示。由圖5可看出，在33與37℃的培養(yǎng)條件下熒光強(qiáng)度在4h內(nèi)快速增加，超過4h后趨于穩(wěn)定;而在40℃下培養(yǎng)，其熒光值明顯偏低;44℃培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液熒光強(qiáng)度不斷增加，7h左右達(dá)到穩(wěn)定且強(qiáng)度超過33與37℃的高值;48℃下培養(yǎng)液基本無熒光現(xiàn)象。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的可能原因是:溫度不僅關(guān)系著大腸桿菌的生長(zhǎng)狀況，進(jìn)而影響GUS的生成與釋放量，同時(shí)還關(guān)系到GUS對(duì)MUG的酶解作用，因此對(duì)熒光強(qiáng)度影響較大。44℃盡管不是大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度，但此溫度可能更有利于GUS從大腸桿菌中的釋放，以及GUS在此溫度下能表現(xiàn)出高活性［10－11］，MUG 被分解得最徹底，熒光強(qiáng)度故而最大。由此可見采用44℃培養(yǎng)是最佳反應(yīng)條件。

圖5 培養(yǎng)溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

2.3 大腸桿菌接種量與熒光強(qiáng)度的關(guān)系

為確證在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下熒光光度法定量檢測(cè)大腸桿菌的可行性，對(duì)大腸桿菌接種量與熒光強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示。在100.9～106.8cells/m L的菌濃范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與大腸桿菌接種量表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系Y=731.03 lgX－783.69(R2=0.9567);若接種量在 102.5～105.5cells/m L范圍內(nèi)，兩者的線性關(guān)系進(jìn)一步提高(R2=0.9893，數(shù)據(jù)未顯示)，說明在本實(shí)驗(yàn)確定的最優(yōu)檢測(cè)條件下，熒光強(qiáng)度大小與大腸桿菌呈一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，因此采用熒光光度法對(duì)大腸桿菌進(jìn)行定量是完全可行的。

2.4 確證實(shí)驗(yàn)

圖6 大腸桿菌接種量與熒光強(qiáng)度的關(guān)系

分別采用熒光光度法和最大可能數(shù)法(GB/T4789.38－2008)對(duì)三份未知濃度的大腸桿菌菌懸液進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果如表1所示。三份樣品的測(cè)定結(jié)果表明，兩種測(cè)定方法之間無顯著性差異，且熒光光度法平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最大為27.1%，低于最大可能數(shù)法的31.4%，表明熒光光度法在大腸桿菌的快速定量中準(zhǔn)確度與精度均較高，結(jié)果可信。

表1 熒光光度法與最大可能數(shù)法定量結(jié)果比較

3 結(jié)論

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果可知，大腸桿菌在超聲處理或曲拉通X－100等滲透處理?xiàng)l件下均可釋放出GUS并分解MUG產(chǎn)生熒光，但熒光效應(yīng)偏弱，誤差較大，無法滿足常規(guī)的大腸桿菌定量要求。而將菌體進(jìn)行培養(yǎng)后再檢測(cè)能很好解決這一問題，最佳操作條件為:采用pH為7.0的LST－MUG培養(yǎng)基在44℃對(duì)菌體培養(yǎng)7h后，調(diào)整pH至10，此時(shí)培養(yǎng)液的熒光強(qiáng)度與大腸桿菌接種量(100.9～106.8cells/m L范圍內(nèi))呈良好的線性關(guān)系。該處理?xiàng)l件進(jìn)一步縮短了檢測(cè)時(shí)間，包括前處理及測(cè)定步驟整個(gè)過程約8h，最低檢測(cè)限降至100.9cells/m L。當(dāng)然，由于本次實(shí)驗(yàn)采用的是標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌菌懸液為測(cè)試樣本，干擾因素較少取得了理想的效果，但對(duì)組成復(fù)雜的環(huán)境或食品測(cè)試樣本效果如何以及可行的解決措施，有待于下一步的研究。

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Study on the rapid enumeration of Escherichia coli with fluorescent method

GUAN Xiao，NONG Wei－liang，CAO Hui，YAO Yuan
(School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai200093，China)

The effect of osmotic treatment and culture on the detection of E.coli with fluorescent method were discussed respectively，and the effect of culture conditions on fluorescent intensity also investigated.The results indicated that only osmotic treatment for E.coli would cause small fluorescent intensity and low detection sensitivity.However，fluorescent intensity obtained under the conditions of cultured for 7h at 44℃ in the LST－MUG culture medium could quantified the E.coli in the range of 100.9～106.8cells/m L，and the results obtained by this method and standard method showed no significant difference.Optimized fluorescent method shortened the detection time to 8h，and showed good reproducibility.Therefore，the method described is applicable to the rap id enumeration of E.coli.

Escherichia coli;rapid detection;fluorescence method

TS207.4

A

1002－0306(2011)09－0403－05

2010－09－20

管驍(1979－)，男，博士，講師，研究方向:食品安全快速檢測(cè)。

上海市聯(lián)盟計(jì)劃項(xiàng)目(09LM42);上海市研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(JWCXSL0902);上海市松江區(qū)博士后創(chuàng)新基地項(xiàng)目。