邢慶超，沐萬(wàn)孟，江 波，*，周榴明，儲(chǔ)菲菲，張 濤

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122; 2.羅蓋特美國(guó)公司，基奧卡克52632，美國(guó))

D-阿洛酮糖的分離純化

邢慶超1，沐萬(wàn)孟1，江 波1，*，周榴明2，儲(chǔ)菲菲1，張 濤1

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122; 2.羅蓋特美國(guó)公司，基奧卡克52632，美國(guó))

通過(guò)生物法以D-果糖為原料生產(chǎn)D-阿洛酮糖，產(chǎn)物的分離純化采用陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂脫色脫鹽，再通過(guò)DTF-Ca2+型離子交換樹(shù)脂進(jìn)行分離純化。最佳分離條件:柱溫60℃，10mL進(jìn)樣量，1mL/min流速。通過(guò)高效液相色譜測(cè)定，分離得到的D-阿洛酮糖純度為98.3%。

D-阿洛酮糖，分離，離子交換樹(shù)脂，純化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D-阿洛酮糖標(biāo)樣 Sigma公司;DTF-Ca2+色譜分離樹(shù)脂、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂001×7、陰離子交換樹(shù)脂313 江蘇蘇青集團(tuán);其他試劑 均為分析純。

Agilent 1200系列高效液相色譜 Agilent公司; Sugar-PakTM1糖柱 Waters公司;HL-2B型數(shù)顯恒流泵、DBS-100自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 D-阿洛酮糖的生物酶法轉(zhuǎn)化 根據(jù)報(bào)道，D-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶(D-tagatose-3-epimerase，DTE)家族可以催化D-果糖生成D-阿洛酮糖［6-7］，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的CS-DTE酶，是DTE酶家族中的一種，可以應(yīng)用于生物法生產(chǎn)D-阿洛酮糖。基本反應(yīng)條件為:以1L酶反應(yīng)器為例，含有700g/L的D-果糖，50mmol/L的Tris-HCl，100mmol/L的NaCl，10mmol/L的Co2+，pH8.0。該溶液500mL與發(fā)酵得到的含有CS-DTE酶的濕菌體充分混合，在60℃反應(yīng)10h，得到D-阿洛酮糖和D-果糖的混合物。

1.2.2 D-阿洛酮糖粗樣品處理 經(jīng)過(guò)酶轉(zhuǎn)化得到的D-阿洛酮糖和D-果糖的混合物，分批以8000r/min離心除去菌體，再經(jīng)高溫煮沸使溶液中酶蛋白變性沉淀，再次以12000r/min徹底離心除去溶液中蛋白質(zhì)，獲得混合的糖溶液。

1.2.3 D-阿洛酮糖粗樣品脫鹽脫色 將再生好的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂001×7和陰離子交換樹(shù)脂313分別裝填在兩根長(zhǎng)300mm，直徑25mm的玻璃柱中。用串聯(lián)方式，去離子水先通過(guò)陽(yáng)離子柱，再通過(guò)陰離子柱，待平衡后將混合糖液泵入，進(jìn)行脫色與脫鹽，以除去糖液中的Co2+和NaCl等鹽類。基本條件為:流速1.0mL/min，柱體積分別為50mL，用去離子水洗脫，收集樣品。

1.2.4 離子交換色譜柱層析 脫鹽脫色后的D-阿洛酮糖和D-果糖的混合物，通過(guò)一根長(zhǎng)1m，內(nèi)徑2cm的帶有恒溫夾套的層析柱，柱內(nèi)填充處理好的DTF-Ca2+色譜分離樹(shù)脂，以去離子水作為流動(dòng)相，分別控制不同溫度50、60、70℃，不同填料柱體積200、300、400mL，不同進(jìn)樣量5、10、15mL，不同流速0.5、1、1.5mL/min，洗脫D-阿洛酮糖和D-果糖的混合糖液，并采用分部收集器收集洗脫樣品。

1.2.5 HPLC檢測(cè)D-阿洛酮糖的含量 收集后的樣品通過(guò)高效液相色譜(HPLC)，與D-阿洛酮糖和D-果糖標(biāo)準(zhǔn)樣品比較，定性和定量的檢測(cè)各洗脫樣品中的D-阿洛酮糖和D-果糖的濃度。HPLC的檢測(cè)條件為:色譜柱:Sugar-PakTM1;柱溫:85℃;流動(dòng)相:脫氣后的去離子水;流速:0.4mL/min;進(jìn)樣量: 10μL;檢測(cè)器:示差折光檢測(cè)器。

1.2.6 D-阿洛酮糖和D-果糖的分離度計(jì)算 HPLC檢測(cè)后的數(shù)據(jù)，繪制分離曲線，并計(jì)算分離度，D-阿洛酮糖和D-果糖的分離度定義為［8］:

其中:trp為D-阿洛酮糖保留時(shí)間，trf為D-果糖保留時(shí)間為D-阿洛酮糖色譜峰的半峰寬度為D-果糖色譜峰的半峰寬度;以上單位均為min。

2 結(jié)果與討論

2.1 D-阿洛酮糖的生物酶法轉(zhuǎn)化率

通過(guò)DTE酶法，以D-果糖為底物，在上述條件下生成D-阿洛酮糖，并通過(guò)離心，陰陽(yáng)離子柱除去蛋白、鹽分等雜質(zhì)，經(jīng)HPLC檢測(cè)(見(jiàn)圖1)，生物酶法生產(chǎn)D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率為27.9%。

2.2 D-阿洛酮糖的離子交換樹(shù)脂分離

圖1 HPLC檢測(cè)D-阿洛酮糖含量

2.2.1 不同溫度對(duì)分離效果的影響 根據(jù)HPLC檢測(cè)溫度推算，確定基本條件:進(jìn)樣量10mL，去離子水為流動(dòng)相，流速1mL/min，填料體積為200mL，分別考察柱溫為50、60、70℃時(shí)，對(duì)分離效果的影響。

如圖2所示，通過(guò)分離度計(jì)算公式，在柱溫為50、60、70℃時(shí)，分離度依次為0.97、1.23和1.03，可見(jiàn)60℃分離度最大，效果較好，并以此作為下一步探討分離效果的基本條件。

圖2 溫度對(duì)分離效果的影響

2.2.2 不同填料柱體積對(duì)分離效果的影響 確定基本條件:進(jìn)樣量10mL，去離子水為流動(dòng)相，流速1mL/min，柱溫60℃，分別考察填料柱體積為200、300、400mL時(shí)，對(duì)分離效果的影響。

如圖3所示，當(dāng)填料柱體積為200、300、400mL時(shí)，計(jì)算分離度為0.97、1.37和1.57，可見(jiàn)填料柱體積為400mL時(shí)，分離度最大。根據(jù)色譜理論，提高填料柱體積，可以提高理論塔板數(shù)，有效提高分離效果，但是局限于采用柱子的體積限制，填料最大體積只能達(dá)到400mL，但這為今后工業(yè)分離D-果糖和D-阿洛酮糖提供了參考。

2.2.3 不同進(jìn)樣量對(duì)分離效果的影響 分別采用5、 10、15mL的進(jìn)樣量，基本條件為:去離子水為流動(dòng)相，流速1mL/min，柱溫60℃，400mL填料柱體積，考察不同進(jìn)樣量對(duì)分離效果的影響。

圖3 填料柱體積對(duì)分離效果的影響

如圖4所示，當(dāng)進(jìn)樣量分別為5、10、15mL時(shí)，計(jì)算分離度分別為1.58、1.57和0.47，可以看出5mL進(jìn)樣量的分離度最大，但是與10mL進(jìn)樣量比較，差別并不十分明顯，而15mL進(jìn)樣量時(shí)，分離度非常小，分離效果很不理想?？梢钥闯?，當(dāng)較小進(jìn)樣量時(shí)，柱子本身選擇性壓力較小，當(dāng)大進(jìn)樣量時(shí)，柱子的負(fù)荷很大，在有效塔板數(shù)不變時(shí)，嚴(yán)重影響了柱效，分離效果很差。同時(shí)考慮到分離效率問(wèn)題，5mL進(jìn)樣量和10mL進(jìn)樣量比較差別不大，因此，選擇10mL進(jìn)樣量作為分離的基本條件。

2.2.4 不同流速對(duì)分離效果的影響 分別以0.5、1、1.5mL/min作為流動(dòng)相的流速，在進(jìn)樣量10mL，去離子水為流動(dòng)相，填料體積為400mL，柱溫60℃時(shí)，考察不同流速對(duì)分離效果的影響。

如圖5所示，當(dāng)流速分別為0.5、1、1.5mL/min，計(jì)算分離度分別為1.09、1.57和1.55。從圖5可以看出，在流速為1mL/min時(shí)，分離度最大、分離效果最好。

2.2.5 最佳分離條件 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，可以確定進(jìn)樣量10mL，去離子水為流動(dòng)相，流速1mL/min，柱溫60℃，400mL填料柱體積為最佳分離條件。將分離得到的樣品通過(guò)HPLC檢測(cè)，如圖6所示，保留時(shí)間14.1min和19.5min分別為D-果糖和D-阿洛酮糖。在上述分離條件下，可以得到純度為98.3%的D-阿洛酮糖。

圖4 不同進(jìn)樣量對(duì)分離曲線的影響

圖5 不同流速對(duì)分離效果的影響

3 結(jié)論

3.1 D-阿洛酮糖的生物酶法制備，首次采用Ca2+型離子交換樹(shù)脂對(duì)其產(chǎn)物分離純化，實(shí)驗(yàn)證明，柱溫、填料柱體積、進(jìn)樣量、流速均對(duì)分離效果有一定影響，其中填料柱體積直接影響理論塔板數(shù)，對(duì)分離效果影響最大，這為今后批量生產(chǎn)D-阿洛酮糖奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖6 最佳分離條件下HPLC檢測(cè)圖

3.2 最佳的分離條件為，以Ca2+型DTF離子交換樹(shù)脂為填料，400mL填料體積，裝填在帶恒溫夾套的長(zhǎng)1m，內(nèi)徑2cm的層析柱內(nèi)，在以去離子水作為流動(dòng)相，10mL進(jìn)樣量，1mL/min流速，柱溫60℃時(shí)，分離得到純度為98.3%的D-阿洛酮糖。

［1］鄧健仙.功能性食品甜味劑［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1997:34-39.

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Separation and purification of D-psicose

XING Qing-chao1，MU Wan-meng1，JIANG Bo1，*，ZHOU Liu-ming2，CHU Fei-fei1，ZHANG Tao1
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China; 2.Roquette America，Keokuk，IA 52632，United States)

The D-psicose was convered from D-fructose by the biological production.The technology of separation and purification of D-psicose was established according to the methods of ion exchange resin desalting and bleaching，DTF-Ca2+cation exchange chromatography.The optimal Ca2+cation exchange chromatography conditions:column temperature of 60℃，the input volume of 10mL and the flow velocity of 1mL/min.The purity of D-psicose was 98.3%.

D-psicose;separation;ion exchange resin;purification

TS241

B

1002-0306(2011)09-0236-04

甜味劑是食品添加劑和動(dòng)物飼料行業(yè)中的一項(xiàng)重要產(chǎn)品，在世界范圍內(nèi)的應(yīng)用量位居各添加劑之首，傳統(tǒng)的甜味劑如蔗糖，一般都具有高熱量、高吸收率，被認(rèn)為是引起肥胖癥、糖尿病、心血管疾病、齲齒等的一項(xiàng)重要因素［1-2］。D-阿洛酮糖是一種自然界天然存在極少的稀有糖，其食用后不易被人體代謝，幾乎不產(chǎn)生能量，無(wú)腐蝕，而且具有良好的食品加工特性，作為一種新型的功能性甜味劑配料，在食品開(kāi)發(fā)中可以替代傳統(tǒng)甜味劑，成為功能性食品添加劑研究領(lǐng)域的一項(xiàng)熱門內(nèi)容［3-4］。為了進(jìn)一步研究D-阿洛酮糖的性質(zhì)，推動(dòng)其在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用，獲得大量、價(jià)格合理、純度較高的D-阿洛酮糖便尤為重要。D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向異構(gòu)體，都屬于單糖，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，可以用D-果糖為底物，通過(guò)D-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶家族，生物酶法轉(zhuǎn)化大量生產(chǎn)D-阿洛酮糖，但產(chǎn)物為D-阿洛酮糖和D-果糖的混合物，并且D-果糖含量較高，因此研究D-阿洛酮糖和D-果糖的分離技術(shù)，對(duì)今后工業(yè)化生物法生產(chǎn)D-阿洛酮糖具有重要的指導(dǎo)意義［3-4］。根據(jù)色譜相關(guān)理論，單糖之間可以利用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂實(shí)現(xiàn)分離，原理是通過(guò)配位交換，不同的糖與陽(yáng)離子形成配位絡(luò)合物的形成方式、過(guò)程和其穩(wěn)定程度均不同，從而使不同的糖在陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上具有不同的保留行為，綜合二價(jià)、三價(jià)陽(yáng)離子型樹(shù)脂的分離情況，二價(jià)的Ca2+和Pb2+型樹(shù)脂分離效果明顯優(yōu)于三價(jià)的Fe3+和Al3+樹(shù)脂，Pb2+型樹(shù)脂的分離效果顯著優(yōu)于 Ca2+型樹(shù)脂［5］，但是，因其毒性較大，選用Ca2+型陽(yáng)離子樹(shù)脂更適合食品級(jí)的分離研究，并取得了良好效果。

2010-11-30 *通訊聯(lián)系人

邢慶超(1985-)，男，碩士，研究方向:食品酶技術(shù)。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(JUSRP31002);江蘇省社會(huì)發(fā)展科技支撐項(xiàng)目(BE2010626)。