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土茯苓含量測(cè)定分離度和理論板數(shù)的調(diào)整

2013-10-19 11:56北京市東城區(qū)藥品檢驗(yàn)所100027趙希賢尤立華楊秉呼侯揚(yáng)葉萌楊燕寧聶然
首都食品與醫(yī)藥 2013年24期
關(guān)鍵詞:新婦柱溫板數(shù)

北京市東城區(qū)藥品檢驗(yàn)所(100027)趙希賢 尤立華 楊秉呼 侯揚(yáng) 葉萌 楊燕寧 聶然

在藥品檢驗(yàn)含量測(cè)定時(shí),高效液相色譜法是常用的方法,藥品標(biāo)準(zhǔn)在含量測(cè)定項(xiàng)下對(duì)理論板數(shù)有明確規(guī)定;《中國(guó)藥典》附錄高效液相色譜法中對(duì)分離度也有規(guī)定,“除另有規(guī)定外,待測(cè)組分與相鄰共存物之間的分離度應(yīng)大于1.5?!边@些規(guī)定保證了待測(cè)成分測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確。但由于色譜柱的長(zhǎng)期使用,柱效降低,或者樣品中成分復(fù)雜,某些成分變化,待測(cè)成分經(jīng)過(guò)色譜柱后與其他成分不能完全分離,導(dǎo)致理論板數(shù)或分離度不符合規(guī)定。筆者在測(cè)定土茯苓藥材落新婦苷的含量時(shí),針對(duì)待測(cè)成分落新婦苷與其他成分不能完全分離、理論板數(shù)低的情況,按照《中國(guó)藥典》規(guī)定,對(duì)高效液相色譜的流速、柱溫、進(jìn)樣量等進(jìn)行調(diào)整,采用不同品牌的色譜柱進(jìn)行比較,測(cè)定結(jié)果表明,色譜條件中如果選擇合適的流速、柱溫、進(jìn)樣量,可改變待測(cè)成分的保留時(shí)間(tR),提高理論板數(shù)(N)、分離度(N)等,使之符合要求,保證了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

1 儀器與試藥

WATERS2695液相色譜儀;落新婦苷對(duì)照品(批號(hào):111798-201102);土茯苓對(duì)照藥材(批號(hào):121439-200401,由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供);試劑為分析純,甲醇為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 土茯苓中落新婦苷的含量測(cè)定方法色譜條件、對(duì)照品溶液制備及供試品溶液制備采用《中國(guó)藥典》土茯苓[含量測(cè)定]項(xiàng)下方法。

附表1 不同品牌色譜柱對(duì)保留時(shí)間、分離度、理論板數(shù)的影響

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇-0.1%冰醋酸溶液(39∶61)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為291nm。理論板數(shù)按落新婦苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取落新婦苷對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,加60%甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液,即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約0.8g,精密稱(chēng)定,置圓底燒瓶中,精密加入60%甲醇100ml,稱(chēng)定重量,加熱回流1h,放冷,再稱(chēng)定重量,用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.2 不同品牌色譜柱對(duì)保留特性的影響 采用不同品牌色譜柱進(jìn)行測(cè)定,色譜柱分別為DiscoveryC18(150mm×4.6mm,5μm)和WondasilC18(150mm×4.6mm,5μm),進(jìn)樣量為10μL,流速為0.7ml/min,柱溫為30℃,按照土茯苓中落新婦苷的含量測(cè)定方法,測(cè)定保留時(shí)間、分離度、理論板數(shù),數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)附表1。

附表2 不同流速對(duì)保留時(shí)間、分離度、理論板數(shù)的影響

附表3 不同進(jìn)樣量對(duì)分離度、理論板數(shù)的影響

附表4 不同柱溫對(duì)保留時(shí)間、分離度、理論板數(shù)的影響

不同品牌色譜柱在測(cè)定土茯苓中的落新婦苷時(shí),保留時(shí)間、分離度、理論板數(shù)不相同,其中DiscoveryC18分離度較差,分析原因?yàn)榇酥咽褂幂^長(zhǎng)時(shí)間,但理論板數(shù)均符合規(guī)定。

2.3 不同流速對(duì)保留特性的影響 采用DiscoveryC18色譜柱,進(jìn)樣量為10μL,流速分別為0.3ml/min、0.5ml/min、0.7ml/min、1ml/min,柱溫為30℃,按照土茯苓中落新婦苷的含量測(cè)定方法,測(cè)定保留時(shí)間、分離度、理論板數(shù),數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)附表2。

調(diào)整流速可改變測(cè)定成分的分離度,流速減少,可使保留時(shí)間增加,分離度提高,理論板數(shù)增加,可通過(guò)減少流速的辦法提高分離度和理論板數(shù);但流速的增加與保留時(shí)間的減少呈倒數(shù)關(guān)系,流速減少多少倍,保留時(shí)間增加相同的倍數(shù),即減少流速導(dǎo)致測(cè)定時(shí)間增加。

2.4 不同進(jìn)樣量對(duì)保留特性的影響 采用WondasilC18色譜柱,進(jìn)樣量分別為1μL、2μL、5μL、10μL、15μL,流速為0.7ml/min,柱溫為30℃,按照土茯苓中落新婦苷的含量測(cè)定方法,測(cè)定分離度、理論板數(shù),數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)附表3。

進(jìn)樣量減少,對(duì)提高分離度、理論板數(shù)效果不明顯,分離度、理論板數(shù)只是略微提高,分析原因發(fā)現(xiàn)WondasilC18色譜柱為新使用的色譜柱,當(dāng)更換為使用過(guò)一段時(shí)間的色譜柱如DiscoveryC18色譜柱進(jìn)行測(cè)定時(shí),分離度改變較大。以流速為0.7ml/min,柱溫30℃,分別測(cè)定進(jìn)樣量為5μL、10μL時(shí)的分離度,則進(jìn)樣量5μL時(shí),分離度達(dá)到1.54,符合藥典規(guī)定;而進(jìn)樣量為10μL時(shí),分離度只有1.47。因此減少進(jìn)樣量可以提高分離度,尤其是對(duì)于使用過(guò)一段時(shí)間的色譜柱,進(jìn)樣量的調(diào)節(jié)對(duì)分離度影響較明顯。

2.5 不同柱溫對(duì)保留特性的影響 采用WondasilC18色譜柱,進(jìn)樣量為5μL,流速為0.7ml/min,柱溫分別為25℃、30℃、40℃、50℃、60℃,按照土茯苓中落新婦苷的含量測(cè)定方法,測(cè)定保留時(shí)間、分離度、理論板數(shù),數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)附表4。

柱溫不同,可顯著改變待測(cè)成分的保留時(shí)間、分離度與理論板數(shù)。柱溫升高,保留時(shí)間減少,分離度降低,理論板數(shù)升高(柱溫60℃時(shí)待測(cè)成分因與別的峰合在一起,峰寬加大而致理論板數(shù)降低),因此,若欲提高分離度可采用降低柱溫的方法,而欲提高理論板數(shù)可采用升高柱溫的方法。

3 討論

測(cè)定土茯苓中落新婦苷的含量[1][2],調(diào)整色譜條件,流速和柱溫對(duì)保留時(shí)間、分離度、理論板數(shù)影響較大,進(jìn)樣量多少對(duì)于新使用的色譜柱的分離度影響較小,對(duì)使用過(guò)一段時(shí)間的色譜柱影響稍大。因此當(dāng)測(cè)定土茯苓中落新婦苷的含量時(shí),如果分離度低,不符合規(guī)定,可采用降低柱溫,降低流速,減少進(jìn)樣量等方法,改善分離度;如果理論板數(shù)低,不符合規(guī)定,可采用升高柱溫,降低流速的方法,可顯著增加理論板數(shù)。

在實(shí)際檢驗(yàn)時(shí),更換色譜柱可解決分離度問(wèn)題。但更換色譜柱缺點(diǎn)較多,不僅增加了換柱平衡所需的時(shí)間,且需多備色譜柱,增加檢驗(yàn)成本,增加沖洗色譜柱的有機(jī)溶劑。所以多選擇調(diào)整柱溫、流速、進(jìn)樣量的方法,使分離度、理論板數(shù)符合規(guī)定。

《中國(guó)藥典》附錄高效液相色譜法規(guī)定:正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類(lèi)、流動(dòng)相組成、檢測(cè)器類(lèi)型不得任意改變外,其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、固定相牌號(hào)、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組成的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等,均可適當(dāng)改變,以適應(yīng)具體的色譜系統(tǒng)并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。因此在實(shí)際檢驗(yàn)工作中,可通過(guò)調(diào)整高效液相色譜條件,獲得滿意的保留時(shí)間、分離度和理論板數(shù),更好地提高檢驗(yàn)效率,保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確。

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