李超英，姜金慶

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，河南新鄉(xiāng)453003; 2.河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

諾氟沙星單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用

李超英1，2，姜金慶2，*

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，河南新鄉(xiāng)453003; 2.河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

采用優(yōu)化的碳二亞胺法制備諾氟沙星(NOR)人工抗原，紫外掃描和紅外光譜圖表明人工抗原偶聯(lián)成功。采用細(xì)胞融合技術(shù)篩選抗NOR單克隆抗體(NOR mAb)雜交瘤細(xì)胞株，體內(nèi)誘生腹水法制備NOR mAb，建立間接競爭ELISA(icELISA)標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，篩選的3株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體為IgG1亞型，具k輕鏈;建立的icELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線在PBS中的的線性檢測范圍為0.04～43.6ng/mL，IC50值為0.62ng/mL，檢測限(LOD)為0.02ng/mL;抗體與環(huán)丙沙星(87.2%)、培氟沙星(76.9%)、依諾沙星(66.8%)、恩諾沙星(48.6%)和洛美沙星(36.6%)有較高的交叉反應(yīng)率;禽肉基質(zhì)中NOR添加回收率滿足檢測要求。

諾氟沙星，人工抗原，氟喹諾酮，單克隆抗體，間接競爭ELISA

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、培氟沙星 瑞士Fluka公司;其它FQs標(biāo)準(zhǔn)品 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清蛋白(OVA) Sigma公司;鼠單克隆抗體鑒定試劑盒、碳化二亞胺(EDC)、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)Pierce;N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 日本株式會社;透析袋(8000～14000Da)Solarbio;小鼠骨髓瘤NS0細(xì)胞株 英國國家動物健康研究院惠贈; 96孔聚乙烯酶標(biāo)板、96孔和 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、100mL細(xì)胞瓶 Costar公司;RPMI-1640、HAT、HT培養(yǎng)基 Gibco公司;PEG-1500(50%)Roche;胎牛血清(FBS) 杭州四季清生物工程公司;琥珀酸酐、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、非那西丁、過氧化脲Sigma;其它所有試劑 均為分析純。

MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀、GS15R高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司;DU800核酸蛋白分析儀 美國Beckman-Coulter公司;TENSOR27紅外光譜儀德國Bruker公司;Galaxy S+型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 英國RS-Biotech公司;TS100-F倒置生物顯微鏡 日本Nikon公司;925REL#10超低溫冰箱 Thermo Forma公司;eLINE微量移液器 芬蘭百得公司; SZ-97自動三重蒸餾水器 上海雅榮生化儀器有限公司;PHS-3TC精密酸度計(jì) 上海天達(dá)儀器有限公司。

1.2 人工抗原的合成

參照文獻(xiàn)［13］，采用優(yōu)化的EDC兩步法合成NOR人工抗原(見圖1)。將36mg NOR用3mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解后，加入12mg NHS和38mg EDC，37℃條件下避光反應(yīng)24h。離心后取上清液逐滴加入到4mL含66mg BSA(或40mg OVA)的PBS緩沖液中，37℃條件下避光振蕩反應(yīng)4h。反應(yīng)完成后先用蒸餾水透析3d，再用PBS透析3d，紫外掃描透析液無小分子吸收峰時(shí)分裝于安瓿瓶中，-20℃凍干保存。

圖1 EDC法制備NOR人工抗原的路線圖

1.3 人工抗原的鑒定

分光光度計(jì)法測定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算公式為:蛋白質(zhì)含量(mg/mL)=1.45A280nm-0.74A260nm。參照文獻(xiàn)［14］，用PBS將NOR標(biāo)準(zhǔn)品、BSA和免疫原分別配成0.01mg/mL和1mg/mL的溶液，用DU800核酸蛋白分析儀讀取吸光度值，計(jì)算NOR與BSA的偶聯(lián)比。計(jì)算公式為:Ca/Cb=(ACam×KBbm-ACbm× KBam)/(ACbm×KAam-ACam×KAbm)，其原理和計(jì)算依據(jù)詳見文獻(xiàn)［14］。參照文獻(xiàn)［15］，取NORBSA固體樣品0.1mg，制備KBr壓片，用紅外光譜儀進(jìn)行光譜掃描鑒定。

1.4 單克隆抗體的制備

1.4.1 動物免疫 用NOR-BSA免疫8～10周齡雌性Balb/C小鼠10只，劑量為60μg/只，體積為0.2mL，頸背皮下多點(diǎn)注射。首免用PBS稀釋的免疫原與等體積FCA完全乳化，以后每隔3周加強(qiáng)免疫一次，換用FIA乳化，共強(qiáng)化免疫3次。最后1次免疫后3周斷尾采血分離血清，用間接ELISA和間接競爭ELISA篩選效價(jià)高、抑制效果好的小鼠作為融合備用鼠。融合前3～4d超免小鼠，尾靜脈和腹腔各注射50μg免疫原，體積均為100μL。

1.4.2 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞株篩選［16］融合前4～5d用含有8-氮鳥嘌呤的完全培養(yǎng)基(含15%FBS的RPMI-1640)傳代培養(yǎng)NS0細(xì)胞;前1d用HAT培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞。融合后 10～14d用間接 ELISA和icELISA篩選強(qiáng)陽性、抑制率高、生長狀態(tài)好的雜交瘤細(xì)胞株，用有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆。篩選的單克隆細(xì)胞株用含10%DMSO的培養(yǎng)基在液氮中保存。

1.4.3 單抗制備與鑒定 雜交瘤細(xì)胞濃度達(dá)到約107/mL時(shí)，向10d前經(jīng)液體石蠟處理過的經(jīng)產(chǎn)母鼠腹腔內(nèi)注射單克隆細(xì)胞108/只。10～12d后抽取腹水，抗體用飽和硫酸銨鹽析法純化，分裝后-70℃凍存。分光光度計(jì)法測定蛋白質(zhì)含量;Batty飽和法測定親和常數(shù)(Ka)［17］;單抗試劑盒進(jìn)行亞型鑒定。

1.5 免疫學(xué)檢測方法的建立

間接ELISA和間接競爭ELISA(icELISA)操作程序參考文獻(xiàn)［18］。方陣滴定法優(yōu)化檢測抗原(NOR-OVA)濃度和單抗(mAb)稀釋倍數(shù)，以B/B0值(B是不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)A450值，B0是不加標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)A450值)為縱坐標(biāo)，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，四參數(shù)曲線擬合建立icELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行相關(guān)分析。靈敏度用IC50值表示，代表標(biāo)準(zhǔn)品與檢測抗原偶聯(lián)時(shí)的半數(shù)抑制濃度;線性范圍表示最大信號值20%～80%的抑制率(IC20～I(xiàn)C80);最低檢測限(LOD)以IC15值計(jì)算［19］?？贵w特異性以交叉反應(yīng)率(CR)表示［14］，計(jì)算公式為:CR(%)=(IC50of NOR)/(IC50of competitors)×100%，CR越低，抗體的特異性越強(qiáng)。

1.6 添加回收實(shí)驗(yàn)

將家禽肌肉樣品(雞、鴨、鵝)放入組織均漿機(jī)中混勻，準(zhǔn)確稱取2g樣品，用NOR標(biāo)準(zhǔn)品母液配制成10、20、50ng/g的加標(biāo)濃度。將加標(biāo)樣品置于50mL塑料離心管中，加入乙腈-NaOH溶液10mL，充分混合后，4℃3000r/min離心20min。取出5mL上清液，加入PBS溶液5mL，混勻，上樣檢測。以回收率和變異系數(shù)(CV)確定檢測方法的準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原紫外鑒定

在220～400nm紫外光區(qū)，分別對NOR、BSA和NOR-BSA進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果如圖2所示。NOR的最大吸收峰在271nm，BSA的最大吸收峰在278nm，而NOR-BSA的最大吸收峰在275nm，人工抗原的特征吸收峰發(fā)生了明顯的偏移，其紫外光譜具有明顯的NOR和BSA疊加的特性，證明偶聯(lián)成功，鑒定結(jié)果與文獻(xiàn)［20］相一致。根據(jù)計(jì)算公式，NOR-BSA的偶聯(lián)率為24∶1，同理NOR-OVA的結(jié)合比為16∶1。

圖2 NOR、BSA和NOR-BSA的紫外掃描圖譜

2.2 紅外光譜鑒定

鑒定結(jié)果如圖3所示。BSA和NOR-BSA在2500～3200cm-1和1680～1500cm-1區(qū)域具有相似的吸收，這是BSA中氨基酸的特征峰，說明合成的人工抗原中含有BSA。NOR標(biāo)準(zhǔn)品在1760～1600cm-1區(qū)域和3005～3120cm-1處有強(qiáng)吸收峰，這是羧酸基團(tuán)中羰基和羥基的特征峰;NOR-BSA人工抗原中保留了羰基吸收峰，而羥基吸收峰消失，證明抗原改造和偶聯(lián)成功。

圖3 NOR、BSA和NOR-BSA的紅外光譜圖

2.3 NOR mAb的制備及性能鑒定

細(xì)胞融合10d后觀察融合效果，融合率為82%;間接ELISA和競爭ELISA檢測細(xì)胞上清，陽性率為19%。有限稀釋法三次亞克隆后，篩選出3株抗體分泌穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為N3C5、N7B2和N7D2。細(xì)胞株單抗亞類均為IgG1型，具k輕鏈;親和常數(shù)分別為4.8×109、2.3×1010、5.6×109L/mol。腹水純化后的蛋白質(zhì)含量為3.6～6.1mg/mL。方陣滴定法檢測抗體效價(jià)和靈敏度，N7B2腹水的靈敏度最高，達(dá)到0.62ng/mL。因此，選擇靈敏度最好的N7B2單克隆抗體建立ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行抗體特異性鑒定。

2.4 間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

依據(jù)檢測抗原和單克隆抗體用量少的原則，選擇A450值為1.5～2.0左右時(shí)，檢測抗原和NOR mAb的最大稀釋倍數(shù)為理想工作濃度(數(shù)據(jù)未顯示)，因此確定本實(shí)驗(yàn)體系NOR-OVA最佳包被質(zhì)量濃度為2μg/mL，抗NOR mAb的最佳工作濃度為1∶60000倍稀釋。優(yōu)化的間接競爭ELISA(icELISA)標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，該曲線的回歸方程式為y=-9.852Ln(x) +46.138(R2=0.9655)，IC50值為0.62ng/mL，表明NOR mAb具有較高的靈敏度。根據(jù)公式計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線在PBS中的線性檢測范圍為0.04～43.6ng/mL，最低檢測限(LOD)為0.02ng/mL。

圖4 NOR單克隆抗體間接競爭ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 抗體特異性

NOR mAb的交叉反應(yīng)性決定了抗體的特異性，以FQs同類藥物代替NOR標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。由表1可知，NOR mAb與環(huán)丙沙星(87.2%)、培氟沙星(76.9%)、依諾沙星(66.8%)、恩諾沙星(48.6%)和洛美沙星(36.6%)有較高的交叉反應(yīng)率，這說明該免疫學(xué)方法可同時(shí)檢測6種FQs獸藥殘留。

表1 NOR mAb與FQs功能類似化合物的交叉反應(yīng)率

2.6 添加回收實(shí)驗(yàn)

禽肉樣品添加濃度為10、20、50ng/g，經(jīng)萃取緩沖液提取后，對應(yīng)于1、2、5ng/mL。加標(biāo)樣品稀釋10倍，ELISA曲線檢測靈敏度相應(yīng)下降10倍，其準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。雞肉的回收率和CV值分別為90.8%～99.3%和6.2%～8.8%;鴨肉的回收率和CV值分別為89.7%～110.2%和6.8%～9.6%;鵝肉的回收率和CV值分別為96.6%～101.2%和7.5%～9.8%。結(jié)果表明，間接競爭ELISA具有較高的準(zhǔn)確度，能夠滿足NOR殘留檢測要求。

表2 間接競爭ELISA檢測不同樣品的準(zhǔn)確度

3 討論

3.1 NOR單克隆抗體的制備

免疫分析是以抗原抗體的特異性識別和可逆性反應(yīng)為基礎(chǔ)的痕量分析方法，已在殘留物檢測中得到廣泛應(yīng)用。而抗體質(zhì)量的好壞決定著免疫學(xué)檢測技術(shù)的成敗，其特性主要體現(xiàn)在結(jié)合容量、靈敏度、親和力和特異性等幾個(gè)方面。多克隆抗體(pAb)通常含有干擾雜質(zhì)及不同抗原決定簇誘導(dǎo)的免疫球蛋白，因此試劑盒的檢測性能受到質(zhì)疑。本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞融合技術(shù)篩選出3株雜交瘤細(xì)胞，其中N7B2具有較好的靈敏度(0.62ng/mL)。以N7B2單克隆抗體為基礎(chǔ)，建立了間接競爭ELISA分析方法，并在家禽基質(zhì)中進(jìn)行了NOR殘留物含量檢測，獲得了滿意的回收率。

3.2 NOR單克隆抗體的特異性

由于FQs化合物在A環(huán)的6號位有一個(gè)氟原子，7號位有一個(gè)哌嗪環(huán);在B環(huán)(雜環(huán)芳香環(huán))的1號位有一個(gè)N原子，3號位有一個(gè)羧基，4號位有一個(gè)酮基，因此FQs所共有的特征性基團(tuán)非常明顯。NOR半抗原具備最基本的羧基、酮基和哌嗪環(huán)，而且哌嗪環(huán)上沒有取代基團(tuán)，是制備人工抗原的首選。本實(shí)驗(yàn)利用NOR上3號位羧基進(jìn)行偶聯(lián)，這種方式導(dǎo)致哌嗪環(huán)距離連結(jié)位點(diǎn)最遠(yuǎn)，因此抗體與環(huán)丙沙星(87.2%)、培氟沙星(76.9%)、依諾沙星(66.8%)、恩諾沙星(48.6%)和洛美沙星(36.6%)具有較高的交叉反應(yīng)率。從結(jié)構(gòu)上看，其它檢測化合物因取代基團(tuán)、空間結(jié)構(gòu)差異較大，因此交叉反應(yīng)性可以忽略不計(jì)，這與劉慶堂等的研究結(jié)果相一致［21］。但文獻(xiàn)［21］制備的諾氟沙星單克隆抗體沒有對前邊幾種重要的FQs化合物進(jìn)行特異性檢測。

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Preparation and application of monoclonal antibody against norfloxacin

LI Chao-ying1，2，JIANG Jin-qing2，*
(1.Centre of Laboratory Animal，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，China; 2.College of Animal Science，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，China)

Modified EDC method was employed to synthesize the artificial antigen of norfloxacin(NOR)，which was proved by Ultraviolet absorbance and IR spectra.Cell fusion technology was used to screen anti-NOR hybridoma lines，and monoclonal antibodies(mAbs)were produced by using ascitic fluid in mice.Based on this，an indirect competitive ELISA standard curve was established.This assay was sensitive and had a linear range from 0.04～43.6ng/mL(R2=0.9655)，with IC50and LOD values of 0.62ng/mL and 0.02ng/mL，respectively.The produced mAbs were of the IgG1isotype with a k light chain，and mAb from N7B2 exhibited high cross-reactivities to ciprofloxacin(87.2%)，pefloxacin(76.9%)，enoxacin(66.8%)，enrofloxacin(48.6%)and lomefloxacin(36.6%). The spiking tests indicated that the established icELISA method could be used for determination of NOR residue in poultry.

norfloxacin;artificial antigen;fluoroquinolone;monoclonal antibody;indirect competitive ELISA

Q785

A

1002-0306(2011)09-0210-04

氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)是重要的合成類抗生素，它通過抑制DNA解旋酶，進(jìn)而影響細(xì)菌的生長和復(fù)制，發(fā)揮抗菌效力，具有抗菌譜廣、吸收好和組織穿透力強(qiáng)等特點(diǎn)，在畜牧、水產(chǎn)行業(yè)被廣泛應(yīng)用于治療和預(yù)防細(xì)菌感染，并作為飼料添加劑促進(jìn)動物的生長［1］。長期以來，我國在防治動物細(xì)菌上使用的FQs藥物品種混亂，同類藥物反復(fù)出現(xiàn)，超量使用，耐藥菌株不斷出現(xiàn)，致使藥物用量不斷增大，且效果不佳。而此類藥物殘留對人、畜毒副作用很大，甚至有致畸、致癌、致突變等危害［2］。因此，此類藥物的殘留問題逐漸引起人們的關(guān)注。聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織食品添加劑專家聯(lián)席委員會、歐盟制定了恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等藥物在動物源食品中的最高殘留標(biāo)準(zhǔn)［3］;美國于2005年開始禁止恩諾沙星應(yīng)用于家禽和魚類細(xì)菌疾病的治療;中國農(nóng)業(yè)部也對此類藥物的適用范圍、劑量和停藥期等進(jìn)行了嚴(yán)格限定［4］。FQs殘留檢測的傳統(tǒng)方法有高效液相色譜(HPLC)［2，5］、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)［6-8］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)［9-12］等方法。這些方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，但樣品前處理繁瑣，不適合大批量的市場監(jiān)測要求。而免疫學(xué)檢測方法是建立在抗體對抗原的分子識別上，其主要優(yōu)點(diǎn)是親合力高、快速、簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，能夠?qū)崿F(xiàn)對生物液體的小體積、大通量檢測，逐漸成為世界各國有毒有害殘留物快速檢測的方法之一。本研究選用具備FQs共同結(jié)構(gòu)特征的諾氟沙星(NOR)制備人工抗原，通過細(xì)胞融合技術(shù)篩選抗NOR單克隆雜交瘤細(xì)胞株，制備高親和力單克隆抗體，建立間接競爭ELISA檢測方法。該研究可以優(yōu)化液質(zhì)聯(lián)用和氣質(zhì)聯(lián)用等理化方法的樣品前處理過程，同時(shí)為免疫檢測試劑盒和試紙條的研制提供基礎(chǔ)。

2011-05-13 *通訊聯(lián)系人

李超英(1976-)，女，講師，主要從事醫(yī)用昆蟲與實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理與教學(xué)研究。

十一五國家科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目(2006BAK02A21/1);河南省教育廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(2011A230003)。