崔 倩，蔣益虹，戴 蕾，林 穎

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310029)

蓮房原花青素的提取純化技術(shù)研究

崔 倩，蔣益虹*，戴 蕾，林 穎

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310029)

對(duì)蓮房原花青素的提取純化工藝條件進(jìn)行了研究，得到較優(yōu)提取工藝為:提取溫度50℃，提取溶劑60%乙醇，料液比1∶30，提取時(shí)間30min。采用大孔吸附樹脂D－101、DA－201、DM－301和聚酰胺樹脂對(duì)原花青素進(jìn)行純化，結(jié)果表明，大孔樹脂DA－201對(duì)蓮房原花青素有較好的吸附和洗脫效果，以70%乙醇為洗脫劑，初步得到純化的蓮房原花青素，洗脫率為84.1%。

蓮房，原花青素，提取，純化

蓮房為蓮科藥用植物蓮(Nelumbo Nucifera Gaertn.)的成熟花托(又名蓮蓬殼，Seedpod of the Lotus，簡稱LS)。蓮花歷史悠久，我國約有二百種不同種型的蓮。蓮在我國種植廣泛，據(jù)報(bào)道，1999年種植面積就已經(jīng)超過了40000hm2［1］。蓮子和蓮藕是人們喜愛的食品，而蓮房經(jīng)常都被當(dāng)作廢棄物大量丟棄?！侗静菥V目》中記載，荷花、蓮子、蓮衣、蓮房、蓮須、蓮子心、荷葉、荷梗、藕節(jié)等均可藥用。蓮房體輕，質(zhì)疏松，縱向破開多裂隙似海綿，棕色。蓮房中含有蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、粗纖維、胡蘿卜素、VB、尼克酸、VC及微量蓮子堿等多種化學(xué)成分［2］，為傳統(tǒng)中藥材，具有消淤、止血祛濕之功效。近年報(bào)道，蓮房中富含原花青素——蓮房原花青素(procyanidins of lotus seedpod，簡稱LSPC)，是蓮房的主要活性成分之一?，F(xiàn)代生物活性研究表明，LSPC具有較強(qiáng)的清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化活性［1］、抗心肌缺血［3］、調(diào)節(jié)血脂［4］、抑制癌細(xì)胞生長［5］及防輻射［6］等多種生物活性和藥理作用。然而，目前國內(nèi)外對(duì)于蓮房原花青素的研究多集中在活性功能方面。本研究旨在建立較完善的蓮房原花青素的提取、純化方法，為蓮房資源的綜合利用開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蓮房 將一定量新鮮(去籽)蓮房清潔干凈，撕片，65℃干燥至恒重，粉碎，過100目篩，于干燥避光處保存?zhèn)溆?兒茶素對(duì)照品 中國藥品生物制品檢定所;聚酰胺樹脂 浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠;大孔吸附樹脂 DA－201、DM－301、D－101 天津市海光化工有限公司;無水乙醇、NaOH、冰乙酸等分析純。

722型可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;循環(huán)水式多用真空泵 上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司;HL－2恒流泵 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;Z系列層析柱、BS－100A自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 原花青素含量的測(cè)定(香草醛法)

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精確稱取兒茶素對(duì)照品約10mg，用蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到10m L容量瓶中定容，搖勻，作為母液備用。分別精密吸取 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5m L標(biāo)準(zhǔn)品母液，置于10m L容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。用香草醛法(取1m L樣品于10m L具塞玻璃管中，加入2.5m L濃度為30g/L的香草醛－甲醇溶液，再加入2.5m L濃度為30%的硫酸－甲醇溶液，搖勻，避光反應(yīng)10m in，以去離子水為空白，在最大吸收波長500nm處測(cè)定吸光值)，以濃度為縱坐標(biāo)，吸光值為橫坐標(biāo)，得出回歸方程。

所取標(biāo)準(zhǔn)液的濃度和吸光度值數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理，計(jì)算得回歸方程為 y=2.2868x+0.023，R2=0.9998;其中x為兒茶素濃度，y為波長500nm處測(cè)定的吸光度值。結(jié)果表明兒茶素濃度在0.052～0.26mg/m L范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好。

1.2.2 原花青素含量測(cè)定 取1m L樣品于10m L具塞玻璃管中，加入2.5m L濃度為30g/L的香草醛－甲醇溶液，再加入2.5m L濃度為30%的硫酸－甲醇溶液，搖勻，避光反應(yīng)10m in，以去離子水為空白，在最大吸收波長500nm處測(cè)定吸光值［7］。

1.3 蓮房原花青素的提取

準(zhǔn)確稱取蓮房粉末2g，加入一定量一定濃度的乙醇溶液，于一定溫度(水浴)提取一次，每5min振搖一下。提取一定時(shí)間后進(jìn)行抽濾，濾液定容至100m L，取4m L再定容至50m L，取1m L測(cè)定原花青素含量。

1.4 蓮房原花青素的柱層析純化

1.4.1 樹脂的篩選 選擇4種樹脂，樹脂用95%乙醇浸泡24h，用蒸餾水洗至無酒精味;再用1%NaOH浸泡3～4h，濾掉上層堿液，以蒸餾水洗至中性;用4倍量10%醋酸浸泡3～4h，再用蒸餾水洗至中性并浸泡備用［8］。

準(zhǔn)確稱取處理好的樹脂10g(抽濾去除樹脂表面水分)，置于200m L三角瓶中，加入40m L原花青素粗提液，置于氣浴恒溫振蕩器，30℃、120r/min振蕩24h。取上清液 2m L用蒸餾水定容至 50m L，在500nm處用香草醛法測(cè)定濾液的吸光值［9］得到靜態(tài)吸附率。取吸附平衡的樹脂，用蒸餾水沖洗樹脂至濾液無色，置于三角瓶中加入100m L 90%乙醇洗脫樹脂，于氣浴恒溫振蕩器30℃、120 r/m in振蕩24h，測(cè)定洗脫液的吸光度得到靜態(tài)解吸率。通過對(duì)吸附量、吸附率和解吸率的比較選擇一種合適的樹脂。

1.4.2 靜態(tài)吸附與解吸附

1.4.2.1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)測(cè)定 稱取已處理好的樹脂10g，置于200m L三角瓶中，加入40m L原花青素粗提液，不時(shí)振蕩，每隔30min取1m L溶液定容至10m L，用香草醛法在500nm測(cè)定吸光值，連續(xù)測(cè)定4h左右，觀察樹脂對(duì)原花青素的吸附量與時(shí)間的關(guān)系。

1.4.2.2 靜態(tài)吸附等溫線測(cè)定 稱取6份已處理好的大孔樹脂DA－201，各2.5g，分別置于100m L三角瓶中，加入10m L不同濃度的原花青素粗提液，搖床振蕩(30℃、120r/min)，1h后取 1m L溶液定容至10m L，用香草醛法在500nm處測(cè)定吸光值。

1.4.3 動(dòng)態(tài)吸附與解吸附

1.4.3.1 層析柱的制備和上樣 稱取80g備用樹脂DA－201，濕法裝入內(nèi)徑25mm、高40cm的玻璃交換柱中，樹脂層高度約為25cm。待層析柱中的蒸餾水流盡后，室溫下以上樣流速0.8m L/m in進(jìn)樣，進(jìn)樣濃度為2.33mg/m L的原花青素粗提液150m L。

1.4.3.2 層析柱的洗脫 室溫下用相同的流速上蒸餾水，洗下樹脂中水溶性的雜質(zhì)。大約100m L蒸餾水可洗脫干凈。待水洗流出液為無色后，用50%的乙醇溶液沖洗樹脂吸附柱，洗脫液以0.8m L/m in的速度洗脫，采用部分收集器每5m in收集一管，按順序記為1，2，3……36，再用可見光分光光度計(jì)于波長500nm處用香草醛法檢測(cè)吸光值，觀察洗脫出峰情況。

1.4.3.3 比較不同濃度乙醇的洗脫效果 按照上文所述的上樣方法上樣，吸附結(jié)束后，先用100m L的蒸餾水洗去水溶性雜質(zhì)，再分別選用50%、70%、90%乙醇溶液作為洗脫劑，以0.8m L/m in的洗脫速度對(duì)吸附飽和的大孔樹脂進(jìn)行洗脫。收集洗脫流出液測(cè)定原花青素含量，計(jì)算洗脫率。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮房原花青素提取工藝的研究

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn) 在其它條件相同的情況下，乙醇濃度、提取溫度、時(shí)間和料液比對(duì)提取效果的影響結(jié)果見圖1～圖4。

圖1 乙醇濃度對(duì)蓮房原花青素提取率的影響

圖2 溫度對(duì)蓮房原花青素提取率的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)蓮房原花青素提取率的影響

圖4 料液比對(duì)蓮房原花青素提取率的影響

由圖1可見，乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)，原花青素的提取率最高，再升高原花青素提取率已略有下降的趨勢(shì)，分析產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是隨著乙醇濃度的增大，一些醇溶性雜質(zhì)、親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，這些成分與原花青素競(jìng)爭同乙醇－水分子結(jié)合，從而導(dǎo)致提取率降低［10］。圖2表明，隨著溫度的升高，原花青素的提取率有升高的趨勢(shì)，但是在工業(yè)中溫度的升高需要付出較大的成本，而且溫度升高容易破壞一些活性成分，因而選擇50～60℃比較合適。由圖3可見，時(shí)間對(duì)提取率的影響不大，20m in基本已經(jīng)達(dá)到提取完畢的效果，隨著時(shí)間的延長，提取率反而有減少的現(xiàn)象，很可能是原花青素長時(shí)間加熱被破壞。圖4表明，料液比從1∶15到1∶30，提取率有顯著的增長，而之后再增加溶劑體積，提取率開始下降，因此認(rèn)為1∶30為合適的料液比。

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)四因素三水平設(shè)計(jì)，考察提取溫度、乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間對(duì)蓮房中原花青素提取效果的影響，并分析得到較優(yōu)的實(shí)驗(yàn)組合。因素水平安排如表1。

表1 因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

由表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，蓮房中原花青素的最佳提取工藝為:提取溫度50℃，提取溶劑60%乙醇，料液比1∶30，提取時(shí)間30m in。各種因素對(duì)提取效果影響的主次順序依次為乙醇濃度＞提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間。通過極差分析檢驗(yàn)可知，4種因素對(duì)提取率均有影響。

2.2 蓮房原花青素的柱層析純化

2.2.1 樹脂的篩選結(jié)果 根據(jù)表3，聚酰胺樹脂的吸附率與吸附量均最大，但是解析率最小，這對(duì)于原花青素原料會(huì)有很大的浪費(fèi)，且不利于樹脂的重復(fù)利用;D－101的解析率最高但是吸附率最小，會(huì)導(dǎo)致純化的效率低下;綜合考慮吸附率與解析率，認(rèn)為大孔樹脂DA－201為最佳的選擇。

表3 不同樹脂對(duì)蓮房原花青素的吸附與解析

2.2.2 大孔樹脂DA－201的靜態(tài)吸附與解吸附

2.2.2.1 吸附動(dòng)力學(xué) 大孔樹脂DA－201對(duì)原花青素的吸附率與時(shí)間的關(guān)系見圖5?？梢钥闯?，大孔樹脂DA－201的吸附速度很快，30m in基本已經(jīng)達(dá)到吸附飽和，飽和吸附率在36%左右。因此應(yīng)使吸附時(shí)間大于30m in，以確保吸附平衡。

圖5 大孔樹脂DA－201對(duì)蓮房原花青素的吸附動(dòng)力學(xué)曲線

2.2.2.2 靜態(tài)吸附等溫線測(cè)定 不同濃度下樹脂對(duì)原花青素的吸附量關(guān)系如圖6。由圖6可見，原花青素在樹脂上的吸附量隨著提取液濃度的增加而增大。但同時(shí)，吸附率會(huì)隨著提取液濃度的增加而減小，所以選擇濃度時(shí)要綜合考慮。樹脂的吸附率一般與上樣溶液的濃度成反比，通常以較低濃度進(jìn)行吸附較為有利，如果上樣濃度偏高，則吸附率會(huì)顯著減少［11］。

圖6 大孔樹脂DA－201對(duì)蓮房原花青素的吸附等溫線

2.2.3 大孔樹脂DA－201的動(dòng)態(tài)吸附與解吸附 動(dòng)態(tài)上樣的吸附曲線如圖7。

由圖7可見，當(dāng)流出液為74m L時(shí)，樹脂達(dá)到飽和吸附，飽和吸附量為3.4mg/g濕樹脂。

圖7 大孔樹脂DA－201吸附動(dòng)力學(xué)曲線

以原花青素濃度(mg/m L)對(duì)洗脫液體積(m L)作圖得動(dòng)態(tài)解吸曲線，如圖8。

圖8 洗脫曲線

從圖8可見，乙醇溶液通過50m L左右時(shí)，原花青素開始被洗脫下來，然后迅速達(dá)到高峰，乙醇溶液通過120m L后，洗脫液濃度基本保持在一個(gè)低點(diǎn)，有拖尾現(xiàn)象。

2.2.4 比較不同濃度乙醇的洗脫效果 不同濃度乙醇的洗脫率見表4。

表4 不同濃度乙醇的洗脫效果

由表4可知，70%乙醇的洗脫能力高于其他2種濃度的乙醇溶液，為比較適合的洗脫劑，洗脫率可達(dá)84.1%。

分別合并收集到的洗脫液，在40℃減壓蒸餾除去洗脫液中的乙醇和水，通過噴霧干燥可得原花青素產(chǎn)品為淺黃色粉末。

3 結(jié)論

3.1 對(duì)原花青素的提取條件進(jìn)行了探討，結(jié)果表明，蓮房中原花青素的最佳提取工藝為:提取溫度50℃，提取溶劑 60%乙醇，料液比1∶30，提取時(shí)間30m in。在此條件下，采用硫酸－香草醛法，以兒茶素為對(duì)照品，測(cè)定蓮房粉中原花青素的干基含量為7.58%，比一般葡萄籽原花青素的得率(4.6%)高，因此它是一種新的、很有應(yīng)用前景的原花青素生產(chǎn)原料。

3.2 綜合 3種大孔吸附樹脂 D－101、DA－201、DM－301和聚酰胺樹脂的靜態(tài)吸附－解吸附性能，可以看出，大孔吸附樹脂DA－201是最合適的原花青素純化樹脂，具有吸附快、易解吸等特點(diǎn)。

3.3 以DA－201為填充料制備層析柱，上樣流速0.8m L/m in，2.33mg/m L的原花青素粗提液達(dá)到吸附飽和的時(shí)間為92m in，濕樹脂的動(dòng)態(tài)飽和吸附量為3.4mg/g。相同流速下，100m L的蒸餾水可以洗去溶于水的雜質(zhì)。

3.4 分別選用50%、70%、90%乙醇溶液作為洗脫劑，得到洗脫率最高的為70%的乙醇。上柱液濃度為2.97mg/m L，流速為0.8m L/m in時(shí)，70%的乙醇溶液洗脫率達(dá)到84.1%，且出峰快，但有拖尾現(xiàn)象。

［1］ZHI－QUN LING，BI－JUN XIE，ER－LING YANG.Isolation，Characterization，and Determination of Antioxidative Activity of Oligomeric Procyanidins from the Seedpod of Nelumbo nucifera Gaertn［J］.J Agric Food Chem，2005，53:2441－2445.

［2］凌智群.蓮房原花青素及其生物、藥理活性研究［D］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001.

［3］凌智群，謝筆鈞，江濤，等.蓮房原花青素對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌缺血的保護(hù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2001，17(6):687－690.

［4］唐瑛，黃光華，吳建軍.蓮房原花青素對(duì)高脂血癥大鼠脂質(zhì)過氧化及內(nèi)皮素的影響［J］.華南國防醫(yī)學(xué)雜志，2008，22(4):9－11.

［5］張海暉，段玉清，陳乾.蓮房原花青素體外抗腫瘤作用研究［J］.食品科技，2007(10):251－254.

［6］段玉清，張海暉，唐瑛，等.蓮房原花青素對(duì)60Co－γ射線致免疫器官損傷的防護(hù)作用［J］.食品科學(xué)，2006，27:220－222.

［7］石翠芳，孫智達(dá).沙棗果肉原花青素的分離純化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(4):137－140.

［8］吳朝霞，孟憲軍，吳朝暉.聚酰胺柱層析提純?cè)ㄇ嗨丶捌洚a(chǎn)物清除·OH自由基能力的研究［J］.食品科學(xué)，2005，26(8):113－116.

［9］趙平，宋學(xué)娟，張?jiān)缕?大孔樹脂對(duì)葡萄籽原花青素的吸附研究［J］.中國中藥雜志，2007(10):2197－2200.

［10］C Prieur，J Rigaud，V Cheynier，et al.Oligomeric and polymeric procyanidins from grape seeds［J］.Phytochemistry，1998，36(3):781－784.

［11］黎海彬，李小梅.大孔吸附樹脂及其在天然產(chǎn)物研究中的應(yīng)用［J］.廣東化工，2005(3):22－25.

Study on the extraction and purification of procyanidins from the seedpod of Nelumbo nucifera Gaertn.

CUI Qian，JIANG Yi－h(huán)ong*，DAILei，LIN Ying

(Bioengineering ＆ Food Science College of Zhejiang University，Hangzhou 310029，China)

The extraction and purification technology of the procyanid ins from the seedpod of Nelumbo nucifera Gaertn.were studied.The optimum extraction conditions were as follows:extraction temperature 50℃，ethanol concentration 60%，the ratio of sample to solvent volume(W/V)1∶30，extraction time 30m in.Under this condition，the yield of procyanid ins was 7.5%.The procyanid ins were further purified with macroporous resins D－101，DA－201，DM－301 and polyamide resin，the results showed that the resin DA－201 had better adsorption and elution of procyanid ins from the lotus seedpod.The ratio of stripping was 84.1%when eluting with 70%ethanol.

lotus seedpod;procyanidins;extraction;purification

TS201.2

B

1002－0306(2011)08－0238－04

2010－01－15 *通訊聯(lián)系人

崔倩(1985－)，女，碩士研究生，從事天然產(chǎn)物方面的研究。

浙江省教育廳課題(N20080086);浙江省科技廳項(xiàng)目(N20080439)。