羅華麗，房震

(1.煙臺職業(yè)學院食品與生化工程系，山東 煙臺 264670； 2.煙臺先進材料與綠色制造山東省重點實驗室，山東 煙臺 264006)

全球每年用于傷口處理的敷料用量急劇增長[1]，過去傳統(tǒng)處理傷口的方法是使用棉紗布覆蓋傷口，可以吸收傷口滲出物，保持傷口干燥，避免傷口被細菌感染。理想的傷口敷料應當能夠提供濕潤、無毒、綠色、安全的環(huán)境，以利于組織再生。理想的創(chuàng)面敷料應當透氣防污、可吸收膿液、無黏附、易更換，同時應價廉、無毒、可生物降解、吸液性和透氣性良好，有助于構建一個傷口組織生長的良好微觀環(huán)境，敷料最好本身具有優(yōu)良的抗菌性能[2-3]。薄膜敷料因自身透明，易于觀察傷口愈合狀況，堪稱一種理想的醫(yī)用敷料，同時其可以維持傷口的濕潤狀態(tài)，有利于傷口愈合，是生物醫(yī)藥領域的研究熱點。近年來，隨著細菌耐藥性的增強導致嚴重感染和傷口難以愈合的事件頻發(fā)，因此對具有抗菌功效的傷口敷料的需求日益緊迫[4]。以往的技術路線是添加抗菌劑，但傷口敷料使用后因丟棄導致抗菌劑在自然環(huán)境中擴散而造成諸多環(huán)境問題，因此尋找一種既具有生物抗菌性且在自然界可以實現(xiàn)生物降解，又對人體安全無毒，甚至達到可食用級別的新型材料，是未來研發(fā)的新方向。薄膜敷料一方面具有止血護創(chuàng)、抗菌無毒、促進愈合等作用；另一方面具有攜帶方便、療效可靠、體積小等優(yōu)點，是開發(fā)綠色環(huán)保的傷口敷料的熱點之一，具有很好的研究價值。

聚-β-(1，4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖，簡稱殼聚糖，是唯一天然存在的陽離子聚合物[5]，將蝦皮蟹殼等海洋生物廢棄物脫鈣、脫蛋白制得甲殼素，再經脫乙酰制備得到殼聚糖[6]。因其良好的生物相容性、可生物降解性、抗菌止血性和生物黏附性，可用作理想的傷口敷料[9]。由于殼聚糖分子鏈上的胺基可以和香草醛的醛基反應，可制備具有特殊功效的材料[7]。木質素是自然界中含量最豐富的天然芳香族高分子聚合物。香草醛化學名稱為3-甲氧基-4-羥基苯甲醛，是從木質素工業(yè)生產得到的唯一芳香單體，屬于天然可食用單醛類調味劑[8]。香草蘭是一種名貴的天然香料植物，經乙醇提取、過濾也可得到香草醛[10]。利用殼聚糖和香草醛等生物質材料，有望制成醫(yī)用水凝膠[11]、止血繃帶[12]、止血海綿[13]、薄膜敷料[14]等新型醫(yī)用材料。

筆者利用殼聚糖與香草醛交聯(lián)反應成席夫堿結構，制備殼聚糖/香草醛抗菌薄膜[15]，具有良好的抗菌性和生物相容性，以期為新型傷口敷料的開發(fā)提供新思路[16](如圖1a所示)。與傳統(tǒng)的傷口敷料相比，殼聚糖薄膜可生物降解，從而避免了對創(chuàng)傷性傷口的清創(chuàng)問題。同時其表現(xiàn)出良好的溶脹能力和吸收液體的性能，這可以確保滲出物的排出，維持有助于傷口愈合的潮濕環(huán)境。該薄膜具有更高的穩(wěn)定性、可生物降解性和pH敏感性，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抗菌性能，在治療皮膚病變方面具有巨大的應用潛力。

圖1 殼聚糖/香草醛膜的研究思路和反應路線

1 實驗部分

1.1 主要原材料

殼聚糖：脫乙酰度≥95%，黏度100～200 MPa.s，上海麥克林生化科技有限公司；

香草醛：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

乙醇：分析純，純度≥99.7%，阿拉丁控股集團有限公司；

溶菌酶：20 000 μg，中美康士生物科技有限公司；

冰乙酸：分析純，純度≥99%，阿拉丁控股集團有限公司；

其他試劑均為國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.2 主要儀器及設備

電子天平：BCE124-1CCN 型，北京賽多利斯天平有限公司；

冷凍干燥機：SCIENTZ-10N/C 型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

萬能材料試驗機：AGS-X 500 N型，日本島津公司；接觸角測量儀：Theta Flex型，瑞典Biolin公司；傅里葉變換紅外光譜(FTIR)儀：IR Tracer-100型，日本島津公司；

掃描電子顯微鏡(SEM)：8230型，德國ZEISS公司；

霧度計：HM-150 型，日本村上色彩MCRL 公司；

熱重(TG)分析儀：Q500 型，瑞士梅特勒托利多公司；

臺式空氣浴恒溫搖床：YCT-80B 型，上海捷呈實驗儀器有限公司。

1.3 殼聚糖/香草醛抑菌膜的制備

殼聚糖/香草醛膜的合成是通過殼聚糖與香草醛的酸縮合反應生成席夫堿進行的，如圖1b 所示。將0.48 g殼聚糖(相當于2.32×10-3mmol的葡萄糖胺重復單元的質量)[17]，溶于24 mL 的0.7%乙酸溶液，放置水浴加熱至70 ℃，將不同物質的量之比的質量分數(shù)為2%的香草醛乙醇溶液緩慢滴加入殼聚糖溶液中，維持磁力攪拌一段時間，敞開瓶口，乙醇揮發(fā)后瓶中體積接近24 mL 時停止反應，轉移至塑料培養(yǎng)皿中，隨后置于55 ℃烘箱中存放24 h后制備殼聚糖/香草醛膜。設計不同配方制備殼聚糖/香草醛膜，通過殼聚糖與香草醛的縮合反應生成席夫堿，改變殼聚糖鏈上胺基與香草醛上醛基之間的摩爾比，制備了一系列殼聚糖/香草醛膜，將殼聚糖/香草醛膜物質的量之比分別為3∶1,5∶1，7∶1的樣品分別命名為1#，2#，3#，制備的不同配比殼聚糖/香草醛膜如圖2所示。

圖2 不同配比殼聚糖/香草醛薄膜

1.4 測試與表征

(1) FTIR測試。采用FTIR儀測試，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為0.5 cm-1，掃描頻率為40次，樣品經溴化鉀壓片后進行測試。

(2)微觀形貌觀測。采用SEM 觀測試樣斷面的微觀形貌。

(3)接觸角測試儀。采用接觸角測試儀，以水為媒介，測試殼聚糖膜在空氣中水的接觸角。依照GB/T 30693-2014測量試樣與去離子水的接觸角。

(4)力學性能測試。采用萬能材料試驗機，在室溫下測試殼聚糖/香草醛膜試樣的斷裂伸長率和拉伸強度。拉伸試樣尺寸為100 mm×10 mm×0.1 mm，夾距保持50 mm，拉伸速率為25 mm/min。依照GB/T 1040.3-2006 使用UTM5504 型力學試驗機測定力學性能。

(5)透光性測試。使用霧度計測試殼聚糖膜的透光性。殼聚糖/香草醛膜厚度為0.1 mm，制備成直徑10 cm的圓形膜片。

(6)熱穩(wěn)定性能測試。采用TG分析儀測定熱穩(wěn)定性能，N2保護，升溫速度15 ℃/min，溫度范圍30～800 ℃。

(7)抗微生物活性測試。

使用大腸桿菌ATCC25922進行抑菌試驗，大腸桿菌儲存在-20 ℃下的20%～40%甘油中。稱取胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化鈉10 g、去離子水1000 mL、瓊脂粉18 g 于三角瓶中，經121 ℃/202 kPa滅菌20 min后，趁熱倒入15 mL培養(yǎng)基于10 cm直徑的大平板中。取0.2 mL 微生物混懸液在平板已凝固的LB 培養(yǎng)基面涂抹均勻后，在平板上打4 mm孔徑，并加入4 μg殼聚糖/香草醛膜碎粉。隨后置于37 ℃氣浴搖床孵育24 h，以評估其抗微生物性能，以殼聚糖作為對照實驗，在標準條件下測量抑菌圈直徑。試驗一式三份，以驗證結果并計算平均值。按照抑制率(%)=(處理菌落直徑-對照菌落直徑)/處理菌落直徑×100%計算抑菌率。

2 結果與討論

2.1 FTIR測試

將殼聚糖/香草醛膜在FTIR光譜儀上掃描400～4 000 cm-1的光譜范圍，分別對純香草醛、純殼聚糖和1#樣品進行溴化鉀壓片，測定三者的FTIR 圖譜，如圖3 所示。由圖3 可以看出，殼聚糖在1 590 cm-1處NH—CO 的振動峰及香草醛在1 660 cm-1處的C=O 吸收峰消失了，而制成的殼聚糖/香草醛膜在1 636 cm-1處出現(xiàn)C=N 的席夫堿結構峰，證明殼聚糖的胺基與香草醛的醛基反應形成席夫堿結構[18]。

圖3 1#殼聚糖/香草醛膜的FTIR圖

2.2 殼聚糖/香草醛膜的形貌

采用溶液澆注法[19]制備殼聚糖/香草醛膜，其外觀如圖4所示，隨著香草醛比例的增加，膜的顏色逐漸變成深黃色。由圖2 可知，使用相機拍攝殼聚糖膜材表面光滑、致密透明。由圖4 觀測其表面較為平整，但是仍形成一定粗糙度的表面，有利于形成類似荷葉表面的疏水作用[20]。隨著香草醛比例的減少，膜的粗糙度有一定程度的增加。

圖4 不同物質的量比殼聚糖/香草醛膜表面的SEM圖

2.3 殼聚糖/香草醛膜的接觸角測試

圖5 為不同殼聚糖/香草醛比的膜接觸角測試圖，表1 為殼聚糖膜接觸角記錄。由圖5 和表1 可知，殼聚糖/香草醛膜在空氣中的接觸角略大于90°，處于臨界值，具有一定的疏水性，但是疏水性不顯著。據(jù)參考文獻[14]報道，殼聚糖膜既有一定的親水性，又有一定的疏水性。由于殼聚糖/香草醛膜表面的微納結構，使得接觸角略大于90°，表現(xiàn)出一定的疏水性。然而隨著香草醛添加量的增大，殼聚糖膜的接觸角逐漸從113.7°降低至93.4°。香草醛本身溶于水，具有一定的親水性。隨著殼聚糖鏈上香草醛的引入，膜的親水性有所提升，因此接觸角呈降低趨勢。

圖5 不同殼聚糖/香草醛物質的量比的膜接觸角測試圖

2.4 殼聚糖/香草醛膜的力學性能測試

圖6 為殼聚糖/香草醛膜的應力-應變曲線。由圖6 可見，隨著添加香草醛比例的增加，殼聚糖/香草醛膜的拉伸應力逐漸增高而應變逐漸降低。3#樣品最大拉伸應力可達3.5 MPa，應變?yōu)?.25%；2#樣品最大拉伸應力可達4.1 MPa，應變僅為2.25%；1#樣品最大拉伸應力可達5.5 MPa，應變僅為1.6%。三種配比的殼聚糖/香草醛膜在經過屈服點后都出現(xiàn)了應變增強現(xiàn)象，這可能是因為在拉伸過程中材料的體積不變，但是橫截面積發(fā)生收縮，使分子鏈之間變得更加緊湊，出現(xiàn)新的物理交聯(lián)，從而在曲線中體現(xiàn)出應變增強。隨著香草醛加入量的增加，殼聚糖/香草醛膜的拉伸強度有所增加，其主要原因在于香草醛接枝殼聚糖后，殼聚糖主鏈間的摩擦力和殼聚糖/香草醛膜氫鍵作用力有所提升，從而表現(xiàn)為拉伸強度的增強[21]。

圖6 殼聚糖膜的應力-應變曲線

2.5 殼聚糖/香草醛膜的透光性測試

圖7 為不同比例殼聚糖/香草醛膜透光率變化趨勢圖，由圖7 可見，3#樣品的透光率達87.13%，1#樣品的透光率達49.58%。這是由于香草醛的醛基和殼聚糖上的氨基反應形成亞胺結構與香草醛的芳環(huán)結構形成共軛π鍵，賦予殼聚糖/香草醛膜顯黃色[22]，隨著香草醛用量的增加，殼聚糖/香草醛膜的透光率下降[23]。

圖7 不同比例殼聚糖/香草醛膜透光率

2.6 殼聚糖/香草醛膜熱穩(wěn)定性能測試

圖8為所制備的殼聚糖膜的TG圖；圖9為不同比例殼聚糖/香草醛膜DTG 曲線。如圖8 和圖9 所示，隨著香草醛用量增加，殼聚糖膜整體熱穩(wěn)定性有所提高，熱重損失有所降低，這是由于殼聚糖分子中還原性NH2被香草醛結構通過C=N 雙鍵交聯(lián)和形成有序團簇的作用所致。TG曲線中第一個臺階沒有醛類物質的快速揮發(fā)所引起的質量損失[24]，由FTIR 圖可見，殼聚糖和香草醛主要形成亞胺鍵，其質量損失主要原因是水與胺單元之間的氫鍵斷裂及水分的揮發(fā)所致[18]。1#膜的最大失重速率溫度在265 ℃，該溫度體現(xiàn)了殼聚糖與香草醛交聯(lián)密度達到最大值。DTG 曲線顯示在265 ℃時質量損失速率達到最大(0.5%/℃)。第二個臺階主要是C—C鍵的斷裂、C—H 斷裂、C—O 斷裂[25]所致，質量進一步下降。Res為殘留質量百分比，由表2可見1#膜的Ts最大，為85.554，說明熱穩(wěn)定性達到最好。

圖8 不同比例殼聚糖/香草醛膜的TG圖

圖9 不同比例殼聚糖/香草醛膜DTG圖

2.7 殼聚糖/香草醛膜的降解性能測試

在模擬感染傷口環(huán)境的條件[26]下，根據(jù)24 h 內的質量損失評估殼聚糖/香草醛膜的生物降解行為。即依次將1#，2#，3#膜切成正方形的小塊并稱重，分別放入3 個5 mL 樣品瓶中各加入5 mL pH＝8.0 Tris-HCl 緩沖液，加入溶菌酶1 mg 于37 ℃恒溫酶解。選擇溶菌酶是因為它存在于傷口液中，并且能夠將殼聚糖水解成低聚物。如圖8a所示，生物降解發(fā)生在三個不同降解速率的階段。圖10為殼聚糖/香草醛物質的量比分別為3∶1，5∶1，7∶1的膜降解性能測試圖。由圖10a可知，第一階段的前3小時內，1#，2#，3#樣品的質量突然分別下降了22%，21%，20%。在接下來第二階段的9 h，生物降解以較慢的方式繼續(xù)，殼聚糖/香草醛膜的質量損失率分別為15%，3%，1%。此外，在接下來第三階段的12 h里，1#，2#，3#膜的質量損失率分別為20%，15%，4%。第一階段的質量損失大與溶菌酶催化的連續(xù)N-乙酰-D-葡糖胺單元之間的O—C 鍵斷裂有關，導致殼聚糖低聚物及其擴散到介質中。溶菌酶加速殼聚糖降解是以內切方式作用于殼聚糖，切斷殼聚糖糖鏈上的β-1，4糖苷鍵[27]。第一階段的大量質量損失與溶菌酶催化的連續(xù)N-乙酰-D-葡糖胺單元之間的O—C 鍵斷裂有關，導致殼聚糖低聚物及其擴散到介質中[28]。第二階段預計溶菌酶催化的O—C鍵的斷裂及亞胺鍵的斷裂所致。第三階段是溶菌酶導致的O—C鍵的斷裂和殼聚糖的溶解侵蝕所致[29]。

圖10 殼聚糖/香草醛膜的降解性能測試圖

研究殼聚糖/香草醛膜在乙酸溶液中降解趨勢。分別稱取0.1 g 的1#，2#，3#膜放入20 mL 5%乙酸溶液中觀察其降解行為。由膜浸入乙酸溶液后，發(fā)生溶脹降解，每隔0.5 h，將溶脹降解的膜過濾、干燥后稱量，計算膜的質量損失比例。

如圖10b 所示，膜降解發(fā)生在三個不同降解速率的階段。因此，第一階段的前2 h，1#，2#，3#膜的質量分別下降了25%，23%，22%(見圖10b)。在接下來第二階段的2 h，乙酸降解以較慢的方式繼續(xù)，殼聚糖/香草醛膜的質量損失分別為20%，18%，16%。此外，在接下來第三階段的2 h里，1#，2#，3#膜質量損失率為18%，16%，12%。第一階段的質量損失大于乙酸和殼聚糖/香草醛膜接觸溶脹降解成殼聚糖低聚物擴散到介質中[30]；第二階段乙酸與席夫堿結構發(fā)生可逆反應，導致亞胺鍵的斷裂所致；第三階段是由于O—C鍵的斷裂和殼聚糖的溶解侵蝕所致。

2.8 抗微生物活性

通過圓盤擴散法[31]對大腸桿菌ATCC25922 進行抑菌試驗，如圖11 所示。將殼聚糖/香草醛膜剪成8 mm× 8 mm 正方形膜片，貼敷在已涂布菌液的LB培養(yǎng)基平板中央，從圖12a1～圖12a3可以觀察到膜上沒有生長大腸桿菌，說明膜本身具有一定的抑菌效果。由于膜本身的抑菌成分無法有效向外圍擴散，所以外圍抑菌圈不顯著。

圖11 不同殼聚糖/香草醛膜粉抑菌效果

圖12 殼聚糖/香草醛膜抑菌效果

表3 為不同殼聚糖/香草醛膜粉抑菌圈直徑數(shù)據(jù)。由表3可見，隨著香草醛比例的增加，膜粉的抑菌率有所下降，這是由于殼聚糖本身帶有的氨基在微生物抑制中起到重要的作用，而殼聚糖和香草醛反應占據(jù)一定比例的胺基，從而表現(xiàn)出隨著香草醛的加入量的增長，抑菌率略有下降。因此，進一步增強殼聚糖/香草醛膜的抑菌率可以考慮引入抑菌效果更強的基團，以協(xié)同增強殼聚糖本身的抑菌作用。

表3 不同殼聚糖/香草醛膜粉抑菌圈直徑數(shù)據(jù)

將滅菌濾紙圓片(5 mm)吸取足量殼聚糖/香草醛制膜液，貼敷在經染菌LB培養(yǎng)基平板中央，放置37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，觀察微生物生長狀況，如圖12b1～圖12b3所示。

表4 為不同殼聚糖/香草醛制膜液抑菌圈直徑數(shù)據(jù)。從表4數(shù)據(jù)可知，殼聚糖/香草醛制膜液由于液體擴散作用良好，3∶1，5∶1，7∶1 三種比例殼聚糖/香草醛制膜液的抑菌率可達85.54%，88.23%和88.53%，具有良好的抑菌效果。

表4 不同殼聚糖/香草醛制膜液抑菌圈直徑數(shù)據(jù)

3 結論

(1)采用澆注法制備不同比例的殼聚糖/香草醛膜，F(xiàn)TIR分析表明殼聚糖的胺基與香草醛的醛基發(fā)生反應，形成席夫堿結構。

(2)力學性能分析表明，隨著香草醛比例的增加，殼聚糖/香草醛膜的拉伸強度逐漸增強，最大可達5.5 MPa；隨著香草醛用量增加，殼聚糖膜整體熱穩(wěn)定性有所提高，熱重損失有所降低。

(3)不透明度分析表明，隨著香草醛添加量的增大，殼聚糖膜的透光性逐漸降低，透光率低至49.58%，殼聚糖膜具備合適的透光性，便于觀察傷口情況。

(4)體外溶菌酶酶解實驗考察殼聚糖/香草醛膜在溶菌酶溶液中酶解24 h 的質量損失率可達58%。非常適合用作皮膚傷口敷料且具有優(yōu)良的可降解性能。乙酸降解實驗發(fā)現(xiàn)，殼聚糖/香草醛膜6 h 即可被溶脹降解達50%，具有顯著的酸降解特性。

(5)抗微生物活性試驗分別考察殼聚糖/香草醛制膜液、膜粉、膜片等三種形式，對大腸桿菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)制膜液的擴散作用良好，具有顯著的抑菌效果。殼聚糖/香草醛膜粉由于沒有充分的液體浸潤，無法有效快速擴散，殼聚糖/香草醛膜粉的抑菌率稍低。殼聚糖/香草醛膜片上沒有生長大腸桿菌，說明殼聚糖/香草醛膜本身具有一定的抑菌效果。

總之，殼聚糖、香草醛屬于可食用材料，開發(fā)新型可降解殼聚糖香草醛抗菌膜，有望用于抗菌止血的傷口敷料、可食用包裝材料等領域，為天然食品級可降解傷口敷料開拓了新途徑。為了進一步提升殼聚糖/香草醛膜的抑菌性能，可以考慮進一步改性，引入抑菌效果更強的基團，以協(xié)同增強殼聚糖膜的抑菌作用。