吳闖，王海翔，孫基桔

(1.揚州大學機械工程學院，江蘇 揚州 225009； 2.南通福樂達汽車配件有限公司，江蘇 南通 226300)

心血管疾病是當前威脅人類健康的主要疾病之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的調(diào)查報告統(tǒng)計，每年有近1 800 萬人死于心腦血管疾病，占比全球死亡人數(shù)的30%以上。同時據(jù)統(tǒng)計，我國現(xiàn)有心血管疾病人數(shù)約為2.9 億，并且患有心血管疾病的人數(shù)仍在急劇的上升。雖然飲食、生活方式的改變和藥物干預是心血管疾病的前瞻性治療方法，但對于嚴重病例，手術仍然是現(xiàn)階段最有效的解決方案。目前臨床上對于心血管疾病主要采取血管搭橋療法，所采用的常見血管移植物大致可分為自體血管移植、異種血管移植和組織工程人工血管。但心血管疾病的治療往往面臨自體血管來源不足、需反復手術、不利于患者的術后恢復等問題。目前，國內(nèi)外開發(fā)的人工血管材料各有其優(yōu)缺點，而理想的組織工程血管需要具有一定的降解性，使其在植入后由宿主細胞重塑，具有和天然血管類似的結構和功能。

研究發(fā)現(xiàn)聚己內(nèi)酯(PCL)可以模仿天然組織，擁有良好的生物相容性以及無毒性等優(yōu)點[1-4]，Li等[5]采用具有細胞黏附序列精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)/亮氨酸-天冬氨酸-纈氨酸(LDV)角蛋白與PCL 共混材料，通過靜電紡絲工藝制備人工血管，二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測發(fā)現(xiàn)角蛋白/PCL可提高細胞活力，凝血檢測發(fā)現(xiàn)血管支架具有良好的細胞親和力。Norouzi 等[6]采用靜電紡絲與冷凍干燥法制備雙層肝素(Hp)化小口徑血管支架，內(nèi)層靜電紡絲PCL與混有Hp的明膠(GEL)層，外層通過冷凍干燥法制備混合Hp 的GEL 層，將細胞種植在人工血管上發(fā)現(xiàn)無明顯血栓形成。雖然PCL 的加入大大提高了生物相容性，但其力學性能以及其疏水性較差等[7]，無法較好地滿足天然血管的條件?？梢?，單獨使用聚合物制備得到的人工血管整體性能不佳，且降解速率不同，進而影響其力學性能。

為了解決上述PCL 作為組織工程材料所面臨的問題，需提高PCL人工血管的力學性能以及使得PCL人工血管更加親水，則需要多種材料復合以及制備技術創(chuàng)新實現(xiàn)優(yōu)勢互補。筆者采用靜電紡絲技術，該技術是一種通過高壓電源，使高分子溶液在高壓電場中噴射形成納米纖維，其所制備出的材料滿足了孔隙率高、力學性能好、生物相容性好等諸多特點，形成的納米纖維層與人體細胞基質(zhì)膜類似，有利于細胞在人工血管上的生長、增殖與鋪展[8]。同時在PCL 溶液中加入熱塑性聚氨酯(TPU)來提高人工血管的力學性能，采用浸漬工藝將從葎草莖提取出來的高長徑比植物納米纖維素(H-CNC)[9]和海藻酸鈉(SA)混合浸入到PCL與TPU紡絲成的人工血管中，并通過無水氯化鈣溶液進行交聯(lián)使其具備優(yōu)良的生物相容性和親水性，解決了PCL的疏水性問題，有利于細胞在人工血管的表面黏附和增殖。

1 實驗部分

1.1 主要原材料

PCL：6500 型，東莞市展陽高分子材料有限公司；

TPU：東莞市展陽高分子材料有限公司；

高長徑比葎草莖納米纖維素：H-CNC，硫酸水解法制備[10]，平均長徑比為63.20，平均直徑為6.84 nm，自制；

N，N-二甲基甲酰胺(DMF)：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

二氯甲烷：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

無水氯化鈣：10005861，國藥集團化學試劑有限公司；海藻酸鈉：分析純，上海展云化工有限公司；泊洛沙姆127：F127，天津佰瑪科技有限公司。

1.2 主要儀器及設備

靜電紡絲機：JDF05 型，長沙納儀儀器有限公司；

磁力攪拌水浴鍋：SHJ-2A 型，常州金壇友良儀器有限公司；

掃描電子顯微鏡(SEM)：GeminiSEM 300 型，德國Carl Zeiss公司；

微機控制電子拉伸試驗機：LT-5000 型，洛泰精密儀器(東莞)有限公司；倒置熒光顯微鏡：M165FC型，德國徠卡公司；多功能酶標儀：Thermo MULTISKAN GO 型，美國Thermo Multiskan公司。

1.3 PCL與TPU電紡混合溶液的配制

將一定質(zhì)量的PCL 溶于DFM 與二氯甲烷的混合溶液(體積比為50∶50)中，通過磁力攪拌水浴鍋常溫攪拌5 h。在PCL 樹脂完全溶于溶劑之后，加入一定質(zhì)量的TPU，其中PCL和TPU質(zhì)量比為8∶2，將其在磁力攪拌水浴鍋中進行37 ℃恒溫水浴磁力攪拌，直至其全部溶解。

1.4 人工血管的制備

取質(zhì)量分數(shù)為10%的PCL與TPU混合溶液，通過靜電紡絲機，選用接收轉(zhuǎn)軸為外徑4 mm 的不銹鋼管，紡絲針頭18 G 針頭，針頭內(nèi)徑為0.84 mm 制備PCL和TPU的混合人工血管。

將PCL 和TPU 混合紡絲溶液導入10 mL 的注射器內(nèi)，其次將泊洛沙姆F127水凝膠均勻涂覆在接收轉(zhuǎn)軸表面，并在以下參數(shù)下進行靜電紡絲：電壓為15 kV，注射速度為1 mL/h，接收距離為10 cm，接收裝置轉(zhuǎn)速為50 r/min，相對濕度為(50±5)%，溫度為25 ℃，時間為5 h。紡絲結束后將制成的人工血管連同接收轉(zhuǎn)軸一起取下豎直放入0～4 ℃的環(huán)境中，待F127 液化后可從接收轉(zhuǎn)軸上輕松滑落，放于無水乙醇中清洗殘余的F127 水凝膠。將清洗后的人工血管放于T型桿上并置于H-CNC和SA的混合浸漬液(質(zhì)量比為5∶2)中12 h，待浸漬結束將人工血管豎直拿出直至人工血管上無液滴滴落后，將其置于無水氯化鈣溶液中進行交聯(lián)，直至人工血管上的浸漬液完成交聯(lián)，取出靜置，直至無液滴滴落，放于無水乙醇中清洗殘余的無水氯化鈣。將人工血管從T型桿上取出，37 ℃恒溫干燥12 h后得到成形的人工血管。

1.5 性能測試與表征

(1)宏、微觀形態(tài)檢測。

對于人工血管的外觀形貌，通過使用游標卡尺對人工血管的壁厚與內(nèi)徑進行測量。對于人工血管的表面微觀形態(tài)則通過SEM 觀察人工血管的表面微觀形貌[11]。之后隨機選取圖中的50 根納米纖維素通過Image J 軟件計算分析納米纖維素直徑后輸入繪制相關圖形[12]。

(2)人工血管力學性能測試。

由于人工血管置于體內(nèi)血液中，而體內(nèi)的血液壓力使其對于人工血管的力學性能有一定要求，需要對人工血管進行拉伸強度、爆破強度等方面的強度測試，從而滿足其臨床一定要求[13-14]。

徑向拉伸強度測試：對人工血管試樣進行徑向拉伸強度的測試，在測試之前，為了消除外界環(huán)境因素的影響，將其浸泡在去離子水中10 min 之后，將人工血管放入到37 ℃恒溫烘箱干燥12 h。將人工血管裁剪成10 mm 長，用兩根直徑2 mm 的U 型細小鋼棒穿過人工血管，將鋼棒固定在拉力機的夾頭上，使拉力機以2 mm/min的速度拉伸人工血管直至斷裂，分析并記錄實驗數(shù)據(jù)。

軸向拉伸強度測試：對人工血管試樣進行軸向拉伸強度的測試，在測試之前，為了消除外界環(huán)境因素的影響，將其浸泡在去離子水中10 min 之后，將人工血管放入到37 ℃恒溫烘箱干燥12 h。將人工血管裁剪成40 mm長，將人工血管兩端固定在拉力機夾頭上，使拉力機以2 mm/min的速度沿軸向方向拉伸直至人工血管斷開，分析并記錄實驗數(shù)據(jù)。

爆破壓力測試：通過拉普拉斯定律[15-16]，可由徑向拉伸強度推算出人工血管的爆破壓力。拉普拉斯定律表明，當直徑為常數(shù)時，爆破壓力與壁厚成正相關，故可通過提高壁厚來增加人工血管的爆破壓力，其計算公式見式(1)。

式中：Pbrust為爆破強度，單位Pa；τ為人工血管的壁厚，單位mm；δc為徑向極限應力，單位Pa；γ為人工血管的半徑，單位mm。

(3)試樣支架孔隙率的表征。

對人工血管試樣進行孔隙率測試，在測試之前，將其放置于在37 ℃恒溫烘箱中12 h，采用無水乙醇對人工血管孔隙率進行檢測表征[17-18]。選一個10 mL 的量筒，加入一定體積的無水乙醇并標記液面高度，然后在萬分之一精度天平上測量其質(zhì)量為W1，把質(zhì)量為Ws的樣品完全浸入到無水乙醇中震蕩。吸走超出液面標記的無水乙醇使其回到刻度位置，稱其質(zhì)量為W2，使無水乙醇充盈于人工血管的納米纖維素孔。把浸滿無水乙醇的樣品取出后，剩余的無水乙醇與量筒的質(zhì)量為W3，其計算公式如下：

式中：P為無水乙醇的密度，單位g/mL；Vs為樣品的納米纖維素體積，單位mL；Vp為樣品人工血管體積，單位mL；H為樣品人工血管的孔隙率，單位%。

(4)試樣水接觸角測試。

親水性是判斷人工血管生物性能的一項重要指標，該項性能可通過測量水接觸角(θ)進行表征，其中θ＞150°表現(xiàn)為超厭水，150°＞θ＞90°表現(xiàn)為厭水，90°＞θ＞10°表現(xiàn)為親水，當θ＜10°表現(xiàn)為超親水。

選用超純水作為檢測液體，測試處理的人工血管試樣的靜態(tài)接觸角。在人工血管的表面各滴加一滴5 μL的超純水，分別在0 s與120 s時通過高速CCD 工業(yè)相機拍攝水接觸角，并通過Image J 軟件計算水接觸角的值。

(5)生物學性能檢測。

為了保證人工血管的生物相容性[19]，需要將細胞接種到制備的葎草莖植物納米纖維素的血管支架上去，通過實驗檢測分析血管支架的生物相容性，故根據(jù)現(xiàn)有實驗條件選擇牛乳腺上皮細胞(BMECs)作為血管支架的接種細胞。生物學性能檢測將其分為4組，分別為對照組、未浸漬海藻酸鈉和H-CNC 的組(簡稱“未浸漬”)、浸漬海藻酸納但沒有H-CNC的組(簡稱“浸漬-”)以及浸漬海藻酸鈉和HCNC的組(簡稱“浸漬+”)。

細胞染色：利用活/死染試劑盒對人工血管上的細胞進行染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞在上面的生長情況。將1 μL 的鈣黃綠素與1 μL 的碘化丙啶(PI)混合在1 mL 的PBS 溶液中。用移液器將混合的溶液分別滴加在不同的人工血管上，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min，之后將人工血管放在倒置熒光顯微鏡下觀察。利用Image J軟件，分析計算活細胞在人工血管上的覆蓋率，計算公式如式(5)。

式中：Pc為人工血管上活細胞的覆蓋率；PCA為活細胞覆蓋面積；PTA為人工血管面積。

細胞毒性檢測：使用多功能酶標儀與CCK-8試劑盒對人工血管進行毒性與增殖檢測。首先將人工血管種植于96 孔板中，分為四組。A 組為對照組，B 組為“未浸漬”，C 組為“浸漬-”，D 組為“浸漬+”。含細胞的組每孔接種細胞數(shù)104pcs，各組加入相同的細胞培養(yǎng)液200 μL。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)設定天數(shù)后分別取出。在取出后加入10 μlL 的CCK-8，再放入培養(yǎng)箱中，分別在2 h 后取出。用多功能酶標儀在450 nm波長處檢測光吸收值(OD值)并記錄實驗數(shù)據(jù)。通過對OD值分析可以反映出人工血管上細胞的狀態(tài)，其計算公式如下：

式中：P為細胞存活率；AS為實驗孔的OD值(含有細胞培養(yǎng)液、CCK-8、待測物質(zhì))；AC為對照孔的OD值(含有細胞培養(yǎng)液、CCK-8、沒有待測物質(zhì))；AB為空白孔的OD值(不含細胞與待測物質(zhì)的培養(yǎng)基、CCK-8)。

2 結果與討論

2.1 人工血管的宏微觀形態(tài)分析

圖1 為人工血管的宏、微觀形態(tài)。通過靜電紡絲機制備的人工血管，其內(nèi)徑為(4.3±0.2) mm，樣本數(shù)(n)=5，壁厚為(0.3±0.06) mm，n=5。制備的人工血管表面光滑無外層脊凸結構，如圖1a 所示；最終制備完成的人工血管成品表面相對光滑，如圖1b 所示。

通過SEM觀察，如圖1c所示，發(fā)現(xiàn)納米纖維素雜亂無章且無明顯串珠生成，從其中隨機選取50根納米纖維素絲通過Image J 軟件分析其直徑得到圖2 纖維直徑分布圖，其中葎草莖納米纖維素浸漬的人工血管的纖維直徑為(210±23) nm，n=50，且纖維直徑服從正態(tài)分布曲線，如圖2所示。

圖2 纖維直徑分布圖

目前認為，纖維的形貌特征較大程度上影響了細胞的黏附、增殖和分化。當紡絲出無序的纖維，一般認為其無序的表面能夠有利于細胞黏附。通過SEM觀察分析可知，人工血管內(nèi)/外層結構光滑，無損傷。所制備的人工血管的纖維成無規(guī)則取向纖維，沒有明顯的串珠現(xiàn)象，為后續(xù)細胞在人工血管上的黏附、增殖和分化提供了基礎。

2.2 人工血管的力學性能探究

圖3 是含H-CNC 和不含H-CNC 人工血管的徑向應力和軸向應力性能測試圖。由圖3可知，含HCNC 人工血管的徑向極限應力為22.79 MPa、軸向極限應力為18.19 MPa，不含H-CNC 人工血管的徑向極限應力為15.54 MPa、軸向極限應力為12.45 MPa。含H-CNC人工血管與不含H-CNC人工血管相比，其徑向與軸向極限應力都有明顯提升，同時由表1 可知，與人體腹主動脈及冠狀動脈所受的最大應力做對比發(fā)現(xiàn)，其力學性能可滿足臨床移植要求。

表1 人工血管的抗拉強度

圖3 含H-CNC和不含H-CNC人工血管的徑向應力和軸向應力性能測試圖

由公式(1)計算得到人工血管的爆破強度2 279 kPa，約為17 094 mmHg，大于人體承受最大壓力的隱靜脈的(1 680±307) mmHg，約為(223±40.8)kPa[20-21]。

由上述分析可知，所制備的人工血管軸向應力、徑向應力、爆破強度等方面都強于人體真實血管的最大應力，表明人工血管具有優(yōu)異的力學性能。

2.3 人工血管的親水性探究

圖4 為血管支架的水接觸角側(cè)視圖，通過高速CCD 工業(yè)相機在固定時間拍攝水接觸角的CCD圖，將圖片導入Image J 軟件中進行分析計算[22-23]。如圖4b 所示，人工血管在0 s 時的水接觸角為114.591°±3.27°，n=3；如圖4c所示，人工血管在120 s時水接觸角不再變化，為77.43°±4.51°，n=3，其性能表現(xiàn)為較親水；然而由圖4d 可見，當去離子水接觸到含葎草莖植物納米纖維素的人工血管時，水滴可被大部分吸收掉，表現(xiàn)為超親水，主要原因是含葎草莖納米纖維素作為一種植物納米纖維素具有親水性，而PCL 具有疏水性，將葎草莖納米纖維素加入到PCL 人工血管中可一定程度上改變其親水性狀態(tài)，增加生物相容性。

圖4 血管支架的水接觸角測試圖

親水性目前已被認為是組織工程人工血管的一個重要特征，支架表面的親水性極大程度上影響了細胞在支架表面的黏附。根據(jù)上述結果分析總結可知，葎草莖植物納米纖維素極大程度上改善了PCL人工血管的疏水性問題，葎草莖植物納米纖維素人工血管具有良好親水性，有利于細胞的黏附和鋪展。

2.4 人工血管的孔隙率分析

表2 為對浸漬過納米纖維素人工血管(樣品1，2，3)孔隙率的三組重復檢測。根據(jù)表2 數(shù)據(jù)，通過公式(2)～公式(4)對三組數(shù)據(jù)采用平均值±標準差的形式(n=3)，計算得到人工血管的孔隙率為81.73%±1.21%，n=3，超過了80%，而較高的孔隙率有利于細胞的黏附增殖，使細胞向人工血管的內(nèi)部生長，并增加人工血管的內(nèi)部彈性空間[24-25]。

表2 人工血管的孔隙率測試數(shù)據(jù)

由上述分析可知，人工血管的孔隙率達到了81.73%±1.21%，n=3，超過了80%，表明人工血管具有高的孔隙率。

2.5 人工血管的細胞相容性分析

作為組織工程應用潛在的人工血管，葎草莖植物納米纖維素人工血管應該能夠促進細胞黏附、增殖、分化，能夠正常維持細胞的生理功能。故而，在葎草莖植物納米纖維素人工血管上種植牛乳腺上皮細胞(BMECs)，測定其細胞相容性。

(1)人工血管的活/死染檢測結果分析。

通過對人工血管上培養(yǎng)的BMECs進行活/死染實驗，得到不同人工血管的活細胞熒光染色圖(圖5)以及死細胞熒光染色圖(圖6)。通過活/死細胞熒光染色圖可以直觀地觀察到葎草莖植物納米纖維素人工血管上的活細胞數(shù)量逐漸增多并且明顯多于同一天的其它兩種人工血管地活細胞數(shù)量，通過Image J軟件計算牛乳腺上皮細胞的覆蓋率可知，第七天細胞在人工血管上的覆蓋率已達到87.48%。

圖5 不同人工血管的活細胞熒光染色圖

圖6 不同人工血管的死細胞熒光染色圖

圖7和圖8分別為牛乳腺上皮細胞在不同人工血管上的細胞覆蓋率對比圖和牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)天數(shù)圖。通過公式(6)計算細胞存活率并得到圖7和圖8，由此分析可知，開始時細胞增殖較快，在第7天時細胞的增殖放緩，可能原因是此時的細胞密度較高，產(chǎn)生了細胞接觸抑制現(xiàn)象，但浸漬過葎草莖纖維素的人工血管的細胞增殖率明顯高于其他兩種人工血管。

圖7 牛乳腺上皮細胞在不同人工血管上的細胞覆蓋率對比圖

圖8 牛乳腺上皮細胞在浸漬+人工血管上的存活率

(2)人工血管的細胞毒性檢測結果分析。

圖9 和圖10 分別為牛乳腺上皮細胞在不同人工血管上的OD值柱狀圖和牛乳腺上皮細胞在不同人工血管上的OD值百分數(shù)柱狀堆積圖。通過對細胞的毒性檢測，并分析圖7和圖8可知，在第七天時不同的人工血管上的細胞的OD 值接近，材料浸提液或材料與其特定植入部位的靶細胞相互作用，反映人工血管細胞毒性的同時還能反映H-CNC 對細胞增殖、分化等功能的影響。結果顯示PCL/TPU/H-CNC 浸提液對BMECs 無明顯影響，且細胞覆蓋率隨著時間的增加相較對照組提升較大，表明HCNC對細胞增殖有明顯促進作用，且細胞毒性并未有明顯的變化。

圖9 牛乳腺上皮細胞在不同人工血管上的OD值柱狀圖

圖10 牛乳腺上皮細胞在不同人工血管上OD值百分數(shù)柱狀堆積圖

在組織工程領域，組織工程支架的生物相容性越來越受到人們的關注，同時生物相容性也受到多種因素影響。通過對細胞的活/死染檢測可知，葎草莖納米纖維素人工血管細胞覆蓋率更高，意味著葎草莖植物納米纖維素人工血管能夠使更多的活細胞更好的黏附和增殖，也意味著擁有更好的生物相容性。

3 結論

筆者采用靜電紡絲法制備葎草莖納米纖維素，并通過浸漬工藝將葎草莖納米纖維素應用到PCL人工血管的制備。通過試驗驗證葎草莖納米纖維素作為一種具有復雜生物活性和優(yōu)異物理性能的纖維聚集體能夠有望改善由PCL 制備的人工血管力學性能差和疏水性等問題。得出如下結論：

(1)葎草莖植物納米纖維素采用浸漬工藝加入到人工血管的制備過程，相比于PCL的人工血管親水性有明顯提升，更加有利于細胞在人工血管表面黏附和鋪展。

(2)葎草莖植物納米纖維素人工血管的力學性能提升明顯，滿足人體腹主動脈及冠狀動脈對于人工血管的力學要求。

(3) BMECs在葎草莖植物納米纖維素人工血管上能夠正常生長，表明H-CNC加入到人工血管中沒有提高其細胞毒性，并且使得牛乳腺上皮細胞在人工血管上能夠更好的黏附和增殖。

結果表明，基于靜電紡絲技術制備的PCL/TPU/H-CNC復合納米纖維素支架，通過TPU作為增強基加入到PCL人工血管的制備，相較于純PCL人工血管，浸漬過葎草莖納米纖維素的人工血管力學性能更加出色。浸漬葎草莖納米纖維素對于疏水性大大改善的同時能夠使更多的活細胞更好的黏附和增殖，細胞增殖作為細胞黏附鋪展與功能分化的中間紐帶，會給材料與機體結合的長期效果帶來十分巨大的影響，也意味著其擁有更好的生物相容性。葎草莖植物納米纖維素在聚己內(nèi)酯人工血管上的應用有望為未來組織工程人工血管領域的發(fā)展提供更好的理論依據(jù)。