莫新良，徐巖，范文來

1(浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院黃酒學(xué)院，浙江紹興，312000)2(江南大學(xué)釀酒科學(xué)與酶技術(shù)中心，釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

香草醛，又名香蘭素，是香子蘭花莢中的典型香氣物質(zhì)。因其具有令人愉悅的香莢蘭豆香氣，廣泛應(yīng)用于食品、飲料等領(lǐng)域中，常作為香料添加于糕點(diǎn)、清涼飲料及酒類等食品中起助香作用［1］。香草醛是橡木桶貯存的葡萄酒中的重要香氣貢獻(xiàn)物質(zhì)，主要來源于植物中木質(zhì)素的降解［2］。

目前香草醛的檢測(cè)方法主要有液相色譜法［3－4］、氣相色譜法［2］、分光光度法［5］、電化學(xué)法［6］等，這些方法的靈敏度較低且線性范圍窄，對(duì)于樣品中含量較低的香草醛無法檢出。近年來有采用氣－質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)方法測(cè)定香草醛的報(bào)道［7］，由于應(yīng)用了質(zhì)譜檢測(cè)器，其定性方便、靈敏度較高，但因樣品前處理操作較繁瑣，未被廣泛應(yīng)用。因此有必要開發(fā)一種簡(jiǎn)便、快速、且靈敏度高的檢測(cè)方法來分析樣品中的微量香草醛。

黃酒是我國的一種傳統(tǒng)發(fā)酵酒，由于其營(yíng)養(yǎng)豐富且風(fēng)味獨(dú)特而深受人們喜愛，香氣是構(gòu)成黃酒風(fēng)味的重要因素，決定著黃酒風(fēng)味的典型性。國內(nèi)對(duì)于黃酒中的揮發(fā)性香氣成分已經(jīng)進(jìn)行了較全面深入的研究［8－9］。在已有研究中，研究者通過氣相色譜聞香法(GC-O)，發(fā)現(xiàn)香草醛是黃酒中的重要香氣物質(zhì)［8］，但有關(guān)黃酒中香草醛的含量在文獻(xiàn)中未見報(bào)道，因此無法根據(jù)濃度從香氣活力值(OAV)的角度來證實(shí)其在黃酒中的重要性。本工作擬采用液－液微萃取結(jié)合氣－質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析黃酒中香草醛的含量，用OAV法分析香草醛對(duì)黃酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)，并對(duì)黃酒貯存過程中香草醛的變化規(guī)律進(jìn)行分析，為黃酒中香草醛的形成和作用機(jī)理研究及高品質(zhì)黃酒的開發(fā)和生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

分析樣品為:浙江地區(qū)，市售黃酒分別命名為ZS-1、ZS-2、ZS-3、ZS-4，以及貯存 4年、5年、6年、9年、11年、12年、13年、14年的原酒;上海地區(qū)，市售黃酒分別命名為SS-1、SS-2，大罐新酒命名為SN-1、SN-2;江蘇地區(qū)，市售黃酒分別命名為JS-1、JS-2，大罐新酒命名為JN-1、JN-2;北方地區(qū)市售黃酒分別命名為 BS-1，BS-2。

香草醛(99%，分析純)和4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮(98%，分析純)購自Sigma-Aldrich(中國)公司;氯化鈉分析純、乙醚(分析純)，購自中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司;無水乙醇(色譜純)，美國TEDIA試劑公司。

水浴恒溫?fù)u床振蕩器(SHA－2型，瑞華儀器)，高速冷凍離心機(jī) J-E，美國 Beckman公司;安捷倫氣－質(zhì)聯(lián)用儀，Agilent 6890 GC-5973 mass selective detector(MSD);MPS2自動(dòng)進(jìn)樣器，德國Gerstel公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取一定量上述香草醛標(biāo)準(zhǔn)品配制到無水乙醇中，再取一定量加入到模擬黃酒中配制成系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)溶液為4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮，用無水乙醇溶解，終濃度均為98.61 μg/L。模擬黃酒采用超純水(Milli-Q系統(tǒng)，Millipore，Badford，MA，USA)配制，其中含有2.5 g/L乳酸，10%(V/V)乙醇，配制好的模擬酒將pH值調(diào)整到4.0。

1.2.2 樣品的濃縮預(yù)處理

取15 mL黃酒樣品于50 mL的離心管中，加4.5 g NaCl，加入內(nèi)標(biāo)4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮，終濃度為98.61μg/L，用1 mL重蒸過的乙醚萃取，將其蓋好后放置于振蕩器上振搖，溫度20℃，轉(zhuǎn)速250 r/min，30 min;振蕩搖勻萃取完成后，于4℃、8 000 r/min的條件下離心15 min，用0.2 mL的移液槍將上清有機(jī)相轉(zhuǎn)移到1mL的小瓶中，取0.1 μL進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.3 GC-MS分析

GC條件:進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度均為溫度250℃，載氣He，流速2 mL/min;進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣;色譜分離柱為DB-FFAP(60 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm，J＆W Scientific);升溫程序:100 ℃ 恒溫 2 min，以10℃/min的速度升溫至 230℃，保持 10 min。

MS條件:電子轟擊(EI)電離源，電子能量70 eV;離子源溫度230℃;質(zhì)量掃描范圍30～550 amu。

1.2.4 物質(zhì)的定性與定量

定性方法:采用全掃描的方式(SCAN)獲得TIC總離子流圖對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分析，未知物通過檢出其譜圖和NIST05a.L Database(Agilent Technologies Inc.)中標(biāo)準(zhǔn)譜圖的比對(duì)，以及與該物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行比較來確定。

定量方法:應(yīng)用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)香草醛進(jìn)行定量分析［10－11］。以 4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮為內(nèi)標(biāo)化合物，采用選擇特征離子法(SIM)對(duì)化合物峰面積進(jìn)行積分，經(jīng)過GC－MS檢測(cè)后利用待測(cè)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)的相對(duì)峰面積比代入相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出待測(cè)物質(zhì)在黃酒中的含量。

1.2.5 香氣活力值(OAV)

香氣活力值是香氣化合物的濃度與該香氣化合物的(以10%乙醇溶液計(jì))香氣閾值濃度之比，用以表征某種香氣化合物對(duì)香氣貢獻(xiàn)的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取溶劑的選擇

香草醛是一種極性較強(qiáng)的物質(zhì)，根據(jù)“相似相容”原理，需用極性較強(qiáng)的溶劑來萃取，故本研究討論了不同萃取溶劑:乙醚、二氯甲烷、乙醚∶二氯甲烷(體積比1∶1)對(duì)香草醛萃取效果的影響。發(fā)現(xiàn)3種萃取劑的效果相似，香草醛的加標(biāo)回收率相近，均能滿足微量成分的分析要求。而用二氯甲烷、乙醚∶二氯甲烷(體積比1∶1)對(duì)香草醛萃取時(shí)，一些色素被萃取出來，故選用乙醚作萃取劑。

2.2 特征離子和定量離子的選擇及香草醛的定性分析

為消除其它雜質(zhì)峰的干擾，采用選擇特征離子的方法(SIM)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和黃酒樣品中的相應(yīng)化合物進(jìn)行掃描。圖1是香草醛和內(nèi)標(biāo)4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的質(zhì)譜圖。由圖1A可知，香草醛的碎片離子豐度最大峰 m/z為81，其次為109和123，m/z為152的是其分子離子峰。由圖1B可知，內(nèi)標(biāo)4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的碎片離子豐度最大峰 m/z為121，其次為43，m/z為178的是其分子離子峰。依據(jù)選擇離子的原則，本方法所選用的香草醛的特征離子 m/z為81、109 、123和152，其中定量離子為152，內(nèi)標(biāo)4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的特征離子m/z為121、178和43，定量離子為121。圖2是標(biāo)準(zhǔn)溶液香草醛及內(nèi)標(biāo)4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的總離子流色譜圖，其出峰時(shí)間分別在21.501 min和26.543 min左右。圖3是黃酒樣品經(jīng)萃取、離心后香草醛的選擇離子流(SIM)色譜圖。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液香草醛及內(nèi)標(biāo)4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的質(zhì)譜圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液香草醛及內(nèi)標(biāo)4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的總離子流色譜圖

圖3 黃酒樣品中香草醛的選擇離子色譜圖

2.3 黃酒中香草醛的定量依據(jù)

2.3.1 工作曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限與定量限

配制一系列濃度的香草醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，根據(jù)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法，做線性回歸分析，結(jié)果見表1。方法的線性關(guān)系良好，相關(guān)性系數(shù)為0.999 7。以信噪比(S/N)為3時(shí)所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物濃度值為檢出限，以信噪比為10時(shí)的濃度值為定量限(表1)。方法的檢出限和定量限分別為7.68 μg/L和 23.05 μg/L，滿足黃酒中香草醛的檢測(cè)要求。

2.3.2 回收率和精密度

將不同濃度的香草醛標(biāo)準(zhǔn)樣品加到模擬酒和實(shí)際樣品溶液中，對(duì)每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定6次，得到相應(yīng)的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(表2)。回收率范圍在94.7% ～101.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均在10% 以內(nèi)。能夠滿足微量成分的準(zhǔn)確分析要求。

表1 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限與定量限

表2 不同樣品的分析結(jié)果及在不同添加水平下香草醛的平均加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

2.4 黃酒中香草醛的定量分析

表3列出了不同地區(qū)不同品種黃酒中香草醛的含量情況。由表可以看出，不同黃酒之間香草醛的含量差異較明顯。仔細(xì)分析發(fā)現(xiàn)，雖然各種黃酒之間存在差異，但是差異之間也有規(guī)律可循，即一般市售普通成品酒如ZS-1、ZS-2等中的香草醛的含量(含量在159.97 ～1 112.41 μg/L)均高于新酒如 SN-1、SN-2、等中香草醛的含量(含量在80.12～100.29 μg/L);浙江地區(qū)市售普通成品酒如ZS-1、ZS-2、ZS-3、ZS-4等中的香草醛的含量高于江蘇、上海(高檔酒如SS-3、SS-4、SS-5除外)及北方地區(qū)市售黃酒中的含量;更有趣的發(fā)現(xiàn)是市售高檔成品酒如SS-3、SS-4、SS-5等中的香草醛的含量(含量均大于3 000 μg/L)均高于低檔酒如市售普通成品酒SS-1、SS-2等中的香草醛的含量。由此不難推斷香草醛這種香氣物質(zhì)在區(qū)分不同黃酒的風(fēng)味差異中起到了非常重要的作用，并且可以推斷貯存過程對(duì)香草醛在黃酒中含量的影響較大。

2.5 黃酒中香草醛的OAV分析

某種香氣物質(zhì)的絕對(duì)含量并不能反映它對(duì)黃酒整體香氣的貢獻(xiàn)，還需要結(jié)合它的香氣閾值來分析。OAV是指香氣化合物的濃度和該化合物香氣閾值之比。通常來說，OAV ＞1.0的化合物會(huì)對(duì)整體香氣有貢獻(xiàn)，并且香氣活性值大的化合物其香氣貢獻(xiàn)亦大［12］。查閱文獻(xiàn)，香草醛在10% 的酒精溶液中香氣閾值為 60 μg/L［13］，根據(jù)香草醛的香氣閾值和濃度之比計(jì)算出其在各黃酒中的OAV，結(jié)果見表3。由表3可知，在所檢測(cè)的黃酒中，香草醛的OAV均大于1，因此其對(duì)該黃酒的整體香氣都有貢獻(xiàn)。其中，普通市售成品酒中的香草醛的OAV一般均大于5(SS-1列外)，高檔市售成品酒(SS-3、SS-4、SS-5)中香草醛的OAV均大于50。因此，從 OAV結(jié)果分析，香草醛是黃酒中重要的香氣貢獻(xiàn)物質(zhì)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在普通紅葡萄酒中，香草醛的OAV在0.7 ～ 2.1［13］，而本研究結(jié)果得到的黃酒中的香草醛的OAV在1.3～67.6，證明香草醛確實(shí)是黃酒中有重要貢獻(xiàn)的香氣化合物，這也是黃酒具有獨(dú)特的風(fēng)味而區(qū)別于其它飲料酒的重要因素之一。

表3 不同黃酒中香草醛的含量(μg/L)及香氣活力值(OAV)

2.6 黃酒貯存過程中香草醛的變化

根據(jù)2.4中的分析，貯存過程對(duì)香草醛在黃酒中含量的影響較大。因此，考察了浙江地區(qū)貯存4年、5年、6年、9年、11年、12年、13年、14年的黃酒原酒中香草醛含量的變化情況，結(jié)果見圖4。由圖4可知，黃酒中香草醛的含量隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)而增加。這種結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道的啤酒和葡萄酒的儲(chǔ)存過程中隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)香草醛的增加情況相類似［14－15］。在葡萄酒貯存中，香草醛主要來源于橡木桶中木質(zhì)素的熱降解［2］，在啤酒貯存中香草醛直接源于4-乙烯基癒瘡木酚的轉(zhuǎn)化，前驅(qū)物質(zhì)是糧谷類植物細(xì)胞壁的阿魏酸［14］，而在黃酒貯存中香草醛的來源和形成機(jī)理則有待進(jìn)一步的考察。

3 結(jié)論

圖4 不同貯存時(shí)間的黃酒中香草醛含量的變化

采用液－液微萃取結(jié)合氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能夠快速、有效地分析黃酒中香草醛的含量，結(jié)果表明香草醛是區(qū)分不同黃酒風(fēng)味差異的重要香氣物質(zhì)。在所研究的黃酒中香草醛濃度高于其閾值，從OAV角度判斷香草醛對(duì)黃酒的風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)黃酒在貯存過程中香草醛含量增加，但其在貯存過程中的形成機(jī)理及影響因素有待進(jìn)一步研究。

［1］Priefert H，Rabenhorst J，Steinbüchel A.Biotechnological production of vanillin［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2001，56(3/4):296－314.

［2］Morales M L，Benitez B，Troncoso A M.Accelerated aging of wine vinegars with oak chips:evaluation of wood flavour compounds［J］.Food Chemistry，2004，88(2):305－315.

［3］Rudnitskaya A，Rocha S M，Legin A，et al.Evaluation of the feasibility of the electronic tongue as a rapid analytical tool for wine age prediction and quantification of the organic acids and phenolic compounds.The case-study of Madeira wine［J］.Analytica Chimica Acta，2010，662(1):82－89.

［4］Waliszewski K N，Pardio V T，Ovando S L.A simple and rapid HPLC technique for vanillin determination in alcohol extract［J］.Food Chemistry，2006，101(3):1 059－1 062.

［5］張國文，倪永年.多元校正－光度法同時(shí)測(cè)定食品中的香蘭素和乙基麥芽酚［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21(1):20－23.

［6］Agüí L，López-Guzmán J E，González-Cortés A，et al.Analytical performance of cylindrical carbon fiber microelectrodes in low-permitivity organic solvents:determination of vanillin in ethyl acetate［J］.Analytica Chimica Acta，1999，385(1-3):241－248.

［7］孫蕊，鄭永杰，張榕.白酒中香草醛兩種測(cè)定方法的研究［J］.齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25(6):68－70.

［8］羅濤.清爽型黃酒香氣特征及麥曲對(duì)其香氣的影響［D］.無錫:江南大學(xué)生物工程學(xué)院，2008.

［9］羅濤，范文來，徐巖，等.我國江浙滬黃酒中特征揮發(fā)性物質(zhì)香氣活力研究［J］.中國釀造，2009，203(2):14－19.

［10］Mo xinliang，Xu yan，F(xiàn)an wenlai.Characterization of aroma compounds in Chinese rice wine Qu by solvent-assisted flavor evaporation and headspace solid-phase microextraction［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58:2 462－2 469.

［11］Mo xinliang，Xu yan.Ferulic acid release and 4-vinylguaiacol formation during Chinese rice wine brewing and fermentation［J］.Journal of the Institute of Brewing，2010，116(3):304－311.

［12］Grosch W.Evaluation of the key odorants of foods by dilution experiments，aroma modelsand omission［J］.Chemical Senses，2001，26(5):533－545.

［13］Culleré L，Escudero A，Cacho J，et al.Gas chromatography-olfactometry and chemical quantitative study of the aroma of six premium quality Spanish aged red wines［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52(6):1 653－1 660.

［14］Vanbeneden N，Saison D，Delvaux F，et al.Decrease of 4-vinylguaiacol during beer aging and formation of apocynol and vanillin in beer［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56(24):11 983－11 988.

［15］Cerdan T G，Mozaz S R，Azpilicueta C A.Volatile composition of aged wine in used barrels of French oak and of American oak［J］.Food Research International，2002，35(7):603－610.