姚興存，蔣 卉，舒留泉，盤賽昆

(淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005)

條斑紫菜活性肽的抗氧化作用

姚興存，蔣 卉，舒留泉，盤賽昆

(淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005)

以條斑紫菜為原料，使用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶水解紫菜蛋白制備活性肽，采用還原能力、清除羥自由基和二苯代苦味?；杂苫鳛榭寡趸栽u價指標(biāo)，研究紫菜活性肽的體外抗氧化活性，并測定其分子質(zhì)量分布。結(jié)果表明：3種蛋白酶對紫菜蛋白具有較好的酶解效果，酶解產(chǎn)物具有一定的還原能力；自由基清除率和底物濃度之間具有正相關(guān)關(guān)系，木瓜蛋白酶酶解活性肽清除羥自由基活性最強(qiáng)，半數(shù)清除率質(zhì)量濃度為0.397mg/mL；胃蛋白酶酶解活性肽清除二苯代苦味?；杂苫钚宰顝?qiáng)，半數(shù)清除率質(zhì)量濃度為0.261mg/mL；經(jīng)測定，具有抗氧化活性的小分子肽分子質(zhì)量分布在148～1963u之間。

條斑紫菜；水解；活性肽；抗氧化

生物活性肽是蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的含有數(shù)個到數(shù)十個氨基酸的多肽類物質(zhì)，不僅具有營養(yǎng)價值，而且在人體代謝吸收過程中參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、降低血壓、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收，具有重要的生理功能。國內(nèi)外學(xué)者對多種來源不同的活性肽進(jìn)行了廣泛的研究，證明其具有較強(qiáng)的清除自由基能力和明顯的抗氧化活性，已經(jīng)成為全球食品和營養(yǎng)學(xué)等相關(guān)研究領(lǐng)域的一個重要發(fā)展方向[1]。近年來，利用現(xiàn)代酶工程技術(shù)，通過選擇適當(dāng)?shù)牡鞍酌高M(jìn)行水解，可以制備各種各樣具有顯著抗氧化作用的生物活性肽[2-6]。

條斑紫菜(Porphyra yezoensis)是海洋食用藻類，大量人工養(yǎng)殖于長江以北的江蘇沿海。紫菜的主要成分有約50%的碳水化合物和30%的粗蛋白[7]，此外還含有豐富的維生素、礦物質(zhì)及生物活性物質(zhì)等。目前紫菜的主要利用途徑是制成紫菜餅干品供直接食用，深加工產(chǎn)品較少。近年來，有學(xué)者制備了壇紫菜和條斑紫菜活性肽，分別研究了其降血壓活性[8-9]，但未見其抗氧化活性的研究報(bào)道。本研究利用當(dāng)?shù)刈喜思庸どa(chǎn)中產(chǎn)生的邊角料或殘次品為原料，提取其中蛋白質(zhì)，選取作用環(huán)境分別為酸性的胃蛋白酶、中性的木瓜蛋白酶、堿性的胰蛋白酶為水解酶，在適宜條件下將紫菜蛋白質(zhì)水解為生物活性肽，研究紫菜活性肽的抗氧化活性，為開發(fā)紫菜保健食品，提高天然紫菜的利用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

條斑紫菜為2010年3月連云港西墅物產(chǎn)有限公司生產(chǎn)紫菜干品時的邊角料，凱氏定氮法[10]測定其蛋白質(zhì)含量為33%。實(shí)驗(yàn)室中將紫菜50℃烘干至質(zhì)量恒定，粉碎機(jī)粉碎，100目過篩后超臨界CO2流體萃取脫去脂肪，儲于廣口瓶中干燥保存。

二苯代苦味酰基(DPPH)、輔酶I(NAD)、桿菌肽鋅(Bacitracin zinc)、藍(lán)色葡聚糖2000(Dextran blue 2000) 美國Sigma公司；SephadexG-15 美國Pharmacia公司；木瓜蛋白酶(酶活力為3×104U/g)、胰蛋白酶(酶活力為2.5×105U/g)、胃蛋白酶(酶活力為3×105U/g)、D-脫氧核糖、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、硫代巴比妥酸(TBA)、抗壞血酸 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；二丁基羥基甲苯(BHT)為進(jìn)口分裝；其他試劑皆為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Duo Flow層析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；Primo R多用途臺式高速冷凍離心機(jī) 美國熱電公司；PHS-3C精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；FW-100高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；KS-300超聲波粉碎機(jī) 寧波科生儀器廠；RE-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 南京金正科教儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫菜蛋白酶解液的制備

精確稱取一定量紫菜干粉，加100mL水混合均勻，超聲輔助提取15min，4000r/min離心10min，取上清液定容到100mL。將提取液調(diào)節(jié)pH值，加入蛋白酶，充分均勻后按表1的適宜條件分別進(jìn)行酶解，每間隔20min振蕩一次，酶解結(jié)束后，100℃滅酶10min，自然冷卻后8000r/min離心15min，收集上清液冷藏備用。

表1 胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的適宜水解條件Table 1 Optimum hydrolysis conditions of three kinds of enzymes

1.3.2 總還原能力測定

采用普魯士藍(lán)反應(yīng)法測定紫菜蛋白酶解液的還原能力[11]。取不同質(zhì)量濃度的酶解液稀釋液(0.15、0.3、0.6、1.2、2.4mg/mL)1.0mL，加入0.2mol/L pH6.6的磷酸緩沖液1mL及質(zhì)量濃度為1g/100mL鐵氰化鉀溶液1.0mL，于50℃水浴反應(yīng)20min后急速冷卻，再加入質(zhì)量濃度為10g/100mL三氯乙酸溶液1.0mL，振蕩均勻后，3000r/min離心10min，取上清液2.5mL，加入蒸餾水2.0mL和質(zhì)量濃度為0.1g/100mLFeCl3溶液0.5mL，混合均勻，靜置10min后于700nm波長處測定其吸光度。吸光度越大，樣品的總還原力就越強(qiáng)。

1.3.3 清除羥自由基(·OH)能力測定

采用酶解產(chǎn)物對Fenton體系產(chǎn)生的·OH清除率的體外實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行測定[12-13]。取0.2mL 10.0mmol/L FeSO4-EDTA混合液于5mL刻度試管中，樣品管及陽性對照管中加入0.5mL 10.0mmol/LD-脫氧核糖溶液，試劑空白管及樣品空白管加入雙蒸水0.5mL。樣品管及樣品空白管加入0.6mL酶解液，其余用0.lmol/L pH7.4磷酸緩沖液定容至1.8mL，再加入0.2mL 10.0mmol/L H2O2?；靹蚝笾糜?7℃恒溫水浴中反應(yīng)lh，然后加入質(zhì)量濃度為2.8g/100mL三氯乙酸溶液1.0mL，4000r/min離心20min，取上清液2.0mL于另一支試管中，加入質(zhì)量濃度為1.0g/100mL硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0mL，混勻后置沸水浴中反應(yīng)15min，冷卻后稀釋5倍，在波長532nm處測其吸光度。酶解產(chǎn)物對·OH的清除效果用清除率表示，按式(1)計(jì)算。

式中：A0為試劑空白的吸光度；A1為陽性對照管的吸光度；A2為樣品管的吸光度；A3為樣品空白的吸光度。

1.3.4 清除DPPH自由基能力測定

DPPH自由基清除率的體外實(shí)驗(yàn)測定參照文獻(xiàn)[14-15]的方法。取不同質(zhì)量濃度的紫菜蛋白酶解液稀釋液(0.075、0.15、0.3、0.6、1.2mg/mL)2mL，加入1×10-4mol/L DPPH無水乙醇溶液2 mL，混勻后在室溫避光反應(yīng)30min，在517nm波長處測定吸光度，空白組以等體積無水乙醇溶液代替DPPH溶液，對照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液，并以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液空白調(diào)零。酶解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除效果用清除率表示，按式(2)計(jì)算。

式中：A0為對照組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為空白組吸光度。

1.3.5 紫菜酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布測定

酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布采用凝膠層析法測定[16-17]，由SephadexG-15柱(1cm×49.6cm)分析檢測。以5mmol/L pH7.0磷酸緩沖液為洗脫液，流速為0.4mL/min，上樣量為2mL，QuadTecTM檢測器檢測，檢測波長280nm。標(biāo)準(zhǔn)品分別為L-酪氨酸(Mr=181.19)、一磷酸腺苷(Mr=347.2)、輔酶I(Mr=681.44)、桿菌肽鋅(Mr=1486.2)，用緩沖液配成5mg/mL的溶液備用，用藍(lán)色葡聚糖2000測定柱床體積(Vt)和柱外水體積(Vo)，然后由標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間計(jì)算出相應(yīng)的洗脫體積(Ve)，以相對分子質(zhì)量的對數(shù)值(lgMr)為橫坐標(biāo)，分配系數(shù)Kav[即(Ve－Vo)/(Vt－Vo)]為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的相對分子質(zhì)量根據(jù)其洗脫體積由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫菜蛋白酶解液的還原力

還原能力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)，抗氧化劑通過自身的還原作用給出電子而使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的分子，從而失去活性，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)[2]。依據(jù)1.3.2節(jié)的測定方法，3種酶解液還原能力測定結(jié)果見表2。

表2 紫菜蛋白酶解液的還原能力(x±s，n=3)Table 2 Reducing power of three hydrolysates (x ± s，n=3A)700nm

由表2可見，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，吸光度也增加，相應(yīng)的還原能力也增強(qiáng)，與陽性對照VC相比較(VC在0.075mg/mL時的吸光度即達(dá)到1.204)，其還原能力還是很弱的。3種蛋白酶酶解物的還原力有明顯差異，還原能力大小順序?yàn)椋何傅鞍酌该附馕?、胰蛋白酶酶解物、木瓜蛋白酶酶解物?/p>

2.2 紫菜蛋白酶解產(chǎn)物清除羥自由基能力

圖1 3種紫菜蛋白酶解液與VC對·OH的清除能力Fig.1 Scavenging rates of three hydrolysates and VC against hydroxyl radicals

·OH是已知的最活潑活性氧自由基，也是毒性最大的氧自由基。3種酶解液和VC對·OH的清除作用結(jié)果如圖1所示。在研究的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增大，其清除能力也逐漸增強(qiáng)。在底物質(zhì)量濃度小于0.775mg/mL時，清除能力大小依次為：木瓜蛋白酶酶解液、胰蛋白酶酶解液、胃蛋白酶酶解液；在底物質(zhì)量濃度大于0.775mg/mL時，清除能力大小依次為：胰蛋白酶酶解液、木瓜蛋白酶酶解液、胃蛋白酶酶解液，胃蛋白酶酶解液的清除能力始終最小。與VC比較，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的紫菜酶解產(chǎn)物對·OH清除能力強(qiáng)于VC，也高于文獻(xiàn)[2]報(bào)道的BHT對·OH的清除率。

為準(zhǔn)確量化比較3種蛋白酶的酶解產(chǎn)物清除·OH活性的大小，將3種酶解液配制成不同質(zhì)量濃度的溶液，測定其對·OH的清除率，繪制清除率對底物濃度曲線，由此計(jì)算出清除率為50%時活性肽溶液的質(zhì)量濃度值即IC50值。IC50值越小，酶解液的清除·OH能力越強(qiáng)，抗氧化能力也越強(qiáng)。圖2為木瓜蛋白酶酶解液對·OH清除能力的量效關(guān)系圖。

圖2 木瓜蛋白酶酶解液對·OH的清除能力Fig.2 Fitted curve of scavenging rate against hydroxyl radicals versus papain hydrolysate concentration

由圖2可見，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物清除·OH能力隨著質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，且清除率與質(zhì)量濃度之間存在良好的對數(shù)回歸關(guān)系，由回歸方程計(jì)算出其IC50值為0.397mg/mL。同樣方法可以測定并計(jì)算胰蛋白酶酶解液IC50值為0.486mg/mL、VC IC50值為1.356mg/mL、胃蛋白酶酶解液IC50值為1.656mg/mL?？梢?，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物對·OH清除能力最強(qiáng)，胃蛋白酶酶解產(chǎn)物最弱。不同蛋白酶對紫菜蛋白的水解作用不同，其酶解產(chǎn)物對·OH的清除能力也存在差異，由于木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量最小，能參加反應(yīng)的氨基酸側(cè)鏈暴露較多，其清除能力也強(qiáng)。

2.3 紫菜蛋白酶解物清除DPPH自由基能力

DPPH自由基是一種較為穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，它具有3個芳環(huán)結(jié)構(gòu)，屬于芳香類自由基，研究抗氧化劑樣品直接捕獲或與DPPH自由基相結(jié)合的行為，可以大致推測抗氧化劑對芳香自由基的清除能力。圖3為3種酶解液和BHT清除DPPH自由基能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

由圖3可見，在研究的酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增大，其清除能力也逐漸增強(qiáng)，呈正相關(guān)關(guān)系。3種酶解液清除能力由大到小為：胃蛋白酶酶解產(chǎn)物、木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物、胰蛋白酶酶解產(chǎn)物，它們的清除能力皆弱于BHT。

圖3 3種紫菜蛋白酶解液與BHT對DPPH自由基的清除能力Fig.3 Scavenging rates of three hydrolysates and BHT against DPPH radicals

為了準(zhǔn)確量化比較3種蛋白酶酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基能力大小，參照研究酶解液清除羥自由基IC50值的方法，將3種酶解液和BHT的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與半數(shù)清除率濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表3。

表3 3種紫菜蛋白酶解液與BHT對DPPH自由基的半數(shù)清除率質(zhì)量濃度Table 3 IC50 concentrations of three hydrolysates and BHT

由表3可見，胃蛋白酶酶解液清除DPPH自由基能力最強(qiáng)，胰蛋白酶酶解液最弱，陽性對照物BHT的半數(shù)清除率質(zhì)量濃度為0.247mg/mL，清除活性高于3種酶的酶解產(chǎn)物?；钚噪膶PPH自由基的清除作用與其自身的氫給予能力有關(guān)，DPPH自由基通過接受電子或H·形成穩(wěn)定的反磁性分子，水解程度越大，活性肽可提供H·的基團(tuán)越少，清除能力越弱。

2.4 酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布

實(shí)驗(yàn)測得SephadexG-15柱的Vo為17.95mL，Vt為38.96mL，由各標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間計(jì)算出相應(yīng)的Ve，進(jìn)而計(jì)算出有效分配系數(shù)Kav，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖4。圖5為木瓜蛋白酶對紫菜蛋白酶解產(chǎn)物的層析色譜圖。

圖4 SephadexG-15凝膠層析測定相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.4 Standard curve for molecular weight determination by Sephadex G-15 column chromatography

圖5 紫菜蛋白木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的SephadexG-15層析色譜圖Fig.5 Sephadex G-15 chromatogram of papain hydrolysate

由圖5可見，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物層析圖譜出現(xiàn)了3個洗脫峰，但第1峰不太明顯，可以不視為單獨(dú)的洗脫峰。因此，具有較高抗氧化作用的活性肽主要為第2、3洗脫峰。經(jīng)計(jì)算第2峰的分子質(zhì)量為1403u，第3峰的分子質(zhì)量為372u。

圖6 紫菜蛋白胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的SephadexG-15層析色譜圖Fig.6 Sephadex G-15 chromatogram of trypsin hydrolysate

經(jīng)測定計(jì)算，胰蛋白酶酶解產(chǎn)物層析圖譜出現(xiàn)了3個洗脫峰，如圖6所示，對應(yīng)的分子質(zhì)量分別為1897、1002u和151u；胃蛋白酶酶解產(chǎn)物層析圖譜同樣出現(xiàn)了3個洗脫峰，如圖7所示，對應(yīng)的分子質(zhì)量分別為1963、1095u和148u。

圖7 紫菜蛋白胃蛋白酶酶解產(chǎn)物的SephadexG-15層析色譜圖Fig.7 SephadexG-15 chromatogram of pepsin hydrolysate

因此，由3種紫菜蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性肽的分子質(zhì)量范圍可知，在3種酶的適宜水解條件下，水解產(chǎn)物主要為分子質(zhì)量在2000u以內(nèi)的小分子肽。

3 結(jié) 論

對3種不同蛋白酶酶解產(chǎn)生的紫菜蛋白酶解產(chǎn)物的總還原能力及清除自由基的能力進(jìn)行了研究，通過還原能力大小、清除率以及半數(shù)清除率質(zhì)量濃度的比較得出結(jié)論：3種蛋白酶酶解產(chǎn)物有一定的還原能力，但弱于VC；酶解產(chǎn)物對·OH和DPPH自由基清除能力與樣品質(zhì)量濃度之間呈正相關(guān)關(guān)系；對·OH清除活性由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋耗竟系鞍酌该附猱a(chǎn)物、胰蛋白酶酶解產(chǎn)物、胃蛋白酶酶解產(chǎn)物，半數(shù)清除率質(zhì)量濃度分別為0.397、0.486、1.656mg/mL；對DPPH自由基清除活性由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋何傅鞍酌该附猱a(chǎn)物、木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物、胰蛋白酶酶解產(chǎn)物，半數(shù)清除質(zhì)量濃度分別為0.261、0.423、1.140mg/mL。綜合以上的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)論，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物在清除兩種自由基方面都具有較強(qiáng)的清除能力，木瓜蛋白酶可以作為今后進(jìn)一步研究的首選蛋白酶。

酶解液用SephadexG-15凝膠層析分離測定，證明其主要為分子質(zhì)量在148～1963u之間的小分子肽。紫菜蛋白水解產(chǎn)生的小分子肽具有良好的抗氧化活性，可以作為生物活性物質(zhì)開發(fā)保健食品或應(yīng)用于食品工業(yè)。

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Antioxidant Activity of Bioactive Peptides fromPorphyra yezoensis

YAO Xing-cun，JIANG Hui，SHU Liu-quan，PAN Sai-kun
(Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

Bioactive peptides were prepared fromPorphyra yezoensisby hydrolysis with papain, trypsin or pepsin, theirin vitroantioxidant activity was assessed based on reducing power and scavenging effects against hydroxyl radicals and DPPH radicals, and their molecular weight distribution was also measured. The results showed that three enzymes could better hydrolyzePorphyra yezoensisproteins, producing hydrolysates with obvious reducing power. The three hydrolysates had dosedependent positive scavenging effects on hydroxyl radicals and DPPH radicals, among which, the papain hydrolysate had the best hydroxyl radical scavenging activity, with a half-scavenging concentration (IC50) of 0.397 mg/mL, and the pepsin hydrolysate was the best scavenger against DPPH radicals with an IC50 of 0.261 mg/mL. The molecular weight distribution of small-molecule antioxidant peptides in the three hydrolysates was determined to be in the range of 148 to 1963 u.

Porphyra yezoensis；hydrolysis；bioactive peptides；antioxidant activity

TS254.1

A

1002-6630(2011)07-0104-05

2010-08-03

江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2008HS015)

姚興存(1963—)，男，副教授，學(xué)士，研究方向?yàn)楹Ｑ筘愒孱惥罴庸づc利用。E-mail：yaoxingcun@126.com