李明顯 夏傳生李娜萍

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院病理研究所武漢 430030;1中國人民解放軍第457醫(yī)院三病區(qū)武漢 430012)

ERCC-1和RRM-1在NSCLC中的表達(dá)及其病理臨床意義

李明顯 夏傳生1李娜萍＊

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院病理研究所武漢 430030;1中國人民解放軍第457醫(yī)院三病區(qū)武漢 430012)

目的 檢測核苷酸切除修復(fù)(NER)系統(tǒng)的 ERCC-1和RRM-1在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中的表達(dá)并分析其表達(dá)的病理臨床意義,為探索NSCLC的有關(guān)發(fā)生機(jī)制及術(shù)后輔助化療提供有用的實驗依據(jù)。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)二步法檢測128例NSCLC組織中 ERCC-1和RRM-1的表達(dá),以10例支氣管擴(kuò)張癥肺組織作為對照。結(jié)果 1.ERCC-1在NSCLC組織中的總體陽性表達(dá)率為44.53%(57/128),在對照組肺組織氣道上皮的陽性表達(dá)率為100%(10/10),ERCC-1在NSCLC組織和對照組的陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);RRM-1在NSCLC組織中的總體陽性表達(dá)率為75%(96/128),在對照組肺組織氣道上皮不表達(dá),RRM-1在NSCLC組織和對照組的陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2.ERCC-1的表達(dá)與NSCLC患者的年齡、組織學(xué)類型及分化程度存在相關(guān)性(P<0.05);RRM-1的表達(dá)與NSCLC患者的年齡存在相關(guān)性(P<0.05)。NSCLC組織中ERCC-1與RRM-1的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論 ERCC-1表達(dá)降低或缺失可能與NSCLC發(fā)生有關(guān);NSCLC組織中存在著ERCC-1與RRM-1的差異表達(dá),提示不同個體的NSCLC其生物學(xué)行為可能不同,因此檢測NSCLC組織中NER系統(tǒng)的表達(dá)情況對選擇NSCLC的個性化輔助化療及估計患者的預(yù)后有指導(dǎo)意義。

錯配切除交叉互補(bǔ)修復(fù)酶1; 核糖核苷酸還原酶M1; 非小細(xì)胞肺癌

近年來,隨著吸煙及各種環(huán)境因素的影響,肺癌 的發(fā)病率和病死率明顯上升,位于癌亡男性患者的首位。最新數(shù)據(jù)表明非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌患者的85%[1],大部分患者發(fā)現(xiàn)時已處于晚期,術(shù)后的長期存活情況并不理想,即使輔助化療也沒有較好的改善,因此總體5年生存率不到5%。新近研究表明,DNA修復(fù)基因修復(fù)力低者肺癌發(fā)生的風(fēng)險較正常人明顯增加,而修復(fù)力高者對化療藥物耐藥,使化療失敗。錯配切除交叉互補(bǔ)修復(fù)酶-1(excision repair crosscompletion1,ERCC-1)是人類核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair,NER)系統(tǒng)的一個重要切除修復(fù)酶,在DNA修復(fù)中起關(guān)鍵作用,其在正常細(xì)胞中的表達(dá)可以降低細(xì)胞突變的幾率。核糖核苷酸還原酶M1(ribonucleotide reductase subunit M1,RRM-1)是核苷酸類似物的化療藥物的結(jié)合位點。RRM-1基因定位于一個可出現(xiàn)于多種惡性腫瘤的雜合子丟失(LOH)區(qū)域。研究表明RRM-1與腫瘤易感性、腫瘤進(jìn)展及對化療藥物的反應(yīng)可能有關(guān)。本研究通過免疫組化法觀察NSCLC組織中是否存在ERCC-1和 RRM-1的表達(dá)異常和表達(dá)差異,分析其表達(dá)的病理臨床意義,探討NSCLC的有關(guān)發(fā)生機(jī)制并為臨床醫(yī)師更多地了解NSCLC患者腫瘤組織的有關(guān)信息、選擇個性化的輔助化療及評價患者的預(yù)后提供有用的依據(jù)。

材料和方法

1. 材料

收集華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院病理科2010年1月至2010年5月經(jīng)手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌組織128例。其中男95例,女33例;年齡37歲-81歲,中位年齡57歲。以10例支氣管擴(kuò)張癥肺組織作為對照,其中男 5例,女5例;年齡 17歲-57歲,中位年齡40.5歲?；颊吲R床資料完整,術(shù)前未行任何放、化療且未合并其他肺部原發(fā)腫瘤。

2.主要試劑

ERCC-1(鼠抗人單克隆抗體,MAB-0600)購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;RRM-1(兔抗人多克隆抗體,ZA-0373)、通用型二步法檢測試劑盒(PV-6000)和DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3.檢測方法

石蠟組織連續(xù)4μm切片,常規(guī)脫蠟至水;高壓修復(fù)中火1min30s,流水沖洗冷卻至室溫,蒸餾水洗滌3次;3%H2O2避光滅活15min,PBS洗滌3次;一抗孵育1h,PBS洗滌3次;二抗孵育30min,PBS洗滌3次;DAB避光顯色3-5min,流水沖洗終止顯色;蘇木素復(fù)染1min,1%鹽酸酒精分化5s,依次脫水透明后中性樹膠封固。以PBS代替一抗作為陰性對照。

4.結(jié)果判斷

ERCC-1表達(dá)于NSCLC癌細(xì)胞核內(nèi),RRM-1表達(dá)于NSCLC癌細(xì)胞胞質(zhì)與胞核,DAB顯色呈棕黃色或棕褐色顆粒狀。光學(xué)顯微鏡下對免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行觀察并計數(shù)。每張切片在10×40倍視野下隨機(jī)選取5個視野,每個視野各計數(shù)150-300個腫瘤細(xì)胞(若不滿足此條件則更換視野),計算陽性細(xì)胞率。陽性細(xì)胞<10%為0分;10%-25%為1分;26%-50%為2分;51%-75%為3分;>75%為4分。按染色強(qiáng)度計分:無著色為0分;淡黃色為1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分?？偡譃?陽性細(xì)胞數(shù)分值×染色強(qiáng)度分值[2],將0-2分判為陰性,>2分判為陽性。

5.統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,性別、年齡、腫瘤大小、組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及p TNM分期等參數(shù)分析應(yīng)用卡方檢驗,病理分級應(yīng)用Spearman等級相關(guān)分析,以 P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.ERCC-1的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示,ERCC-1不同程度地表達(dá)于NSCLC癌細(xì)胞胞核,細(xì)胞核呈棕褐色強(qiáng)陽性著色(圖1A)及棕黃色弱陽性著色(圖 1B)。128例NSCLC中,ERCC-1陽性表達(dá)率為 44.53%(57/128)。其陽性表達(dá)與NSCLC患者的年齡、組織學(xué)類型及分化程度有關(guān),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。ERCC-1在對照組氣道上皮呈棕褐色強(qiáng)陽性著色(圖1C),陽性率為100%(10/10)。兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.RRM-1的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示,RRM-1不同程度地表達(dá)于NSCLC癌細(xì)胞胞質(zhì),細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色強(qiáng)陽性著色(圖 1D)及棕黃色弱陽性著色(圖 1E)。128例NSCLC中,RRM-1陽性表達(dá)率為 75.0%(96/128)。其陽性表達(dá)與患者的年齡有關(guān),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。RRM-1在對照組氣道上皮僅部分呈淡黃色著色(圖1F),無陽性表達(dá)(0/10)。兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3.ERCC-1與RRM-1表達(dá)的相關(guān)性

在NSCLC癌細(xì)胞中,ERCC-1與 RRM-1的表達(dá)呈顯著性正相關(guān)(r=0.406,P<0.01)(表 2)。

圖1 ERCC-1與RRM-1在NSCLC及對照組肺組織中的表達(dá)(EnVisionTM二步法)Fig.1 The expression of ERCC-1 and RRM-1 in NSCLC and compare with normal tissuesA:ERCC-1在NSCLC強(qiáng)陽性表達(dá),×400;B:ERCC-1在NSCLC弱陽性表達(dá),×200;C:ERCC-1在對照組肺氣道上皮細(xì)胞陽性表達(dá),×400;D:RRM-1在NSCLC強(qiáng)陽性表達(dá),×400;E:RRM-1在NSCLC弱陽性表達(dá),×200;F:RRM-1在對照組部分肺氣道上皮細(xì)胞弱陽性表達(dá),×200A:Strong expression of ERCC-1 protein in NSCLC,×400;B:Weak expression of ERCC-1 protein in NSCLC,×200;C:Positive expression of ERCC-1 protein in the the control group,×400;D:Strong expression of RRM-1 protein in NSCLC,×400;E:Weak expression of RRM-1 protein in NSCLC,×200;F:Weak expression of RRM-1 protein partly in the the control group,×200

表1 ERCC-1和RRM-1在NSCLC中的表達(dá)水平與病理臨床特征之間的關(guān)系T able 1 Relationship of ERCC-1 and RRM-1 expression with clinical pathological characteristics in NSCLC

表2 ERCC-1與RRM-1在NSCLC中表達(dá)的相關(guān)性Table 2 Relationship between ERCC-1and RRM-1 expression in NSCLC

討 論

肺癌是全世界癌癥中發(fā)病率和死亡率最高的疾病。吸煙、空氣污染及電離輻射等因素都可不同程度地引起細(xì)胞DNA損傷,并促進(jìn)肺癌的發(fā)生。DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)在維持基因組的完整與穩(wěn)定、糾正錯配復(fù)制、避免可導(dǎo)致嚴(yán)重后果的基因突變及防止細(xì)胞癌變方面起著非常重要的作用。細(xì)胞內(nèi)的NER系統(tǒng)負(fù)責(zé)修復(fù)紫外線照射誘發(fā)的嘧啶二聚體、多環(huán)芳香碳?xì)浠衔?、氧化損傷以及鉑類藥物所致的DNA損傷,ERCC-1和RRM-1是NER系統(tǒng)的兩個重要成員。

近年來肺癌的耐藥性已經(jīng)成為臨床治療的一個難題。ERCC-1是NER系統(tǒng)的限速酶,被認(rèn)為是NER系統(tǒng)的先導(dǎo)基因,負(fù)責(zé)對損傷進(jìn)行識別和剪切,在DNA單鏈?zhǔn)軗p處的5’端進(jìn)行剪切,并以互補(bǔ)鏈為模板進(jìn)行復(fù)制的方式來維護(hù)基因組的完整性,其功能活性的高低可反映整個NER系統(tǒng)的修復(fù)活性[3]。順鉑和卡鉑是目前臨床上最常用的肺癌化療藥物,鉑類藥物與腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)合形成鏈內(nèi)和鏈間的泡狀加合物,使DNA復(fù)制受到抑制,從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。Junichi等[4]認(rèn)為細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力可能是肺癌對鉑類耐藥的重要因素,而ERCC-1被認(rèn)為是其中的主要原因。ERCC-1在DNA的修復(fù)方面發(fā)揮了雙刃劍的作用:一方面在正常細(xì)胞中的高表達(dá)起著穩(wěn)定細(xì)胞DNA、防止其突變的抑癌作用,另方面研究表明其表達(dá)水平也可能影響不同發(fā)展時期NSCLC患者對鉑類藥物的敏感性,早期術(shù)后患者中 ERCC-1高表達(dá)者比低表達(dá)者生存期顯著延長,另一方面在接受鉑類化療的晚期NSCLC患者中,ERCC-1陽性表達(dá)者較陰性者預(yù)后差。在基因水平,Chiun等[5]研究發(fā)現(xiàn) ERCC-1 mRNA高表達(dá)與順鉑耐藥相關(guān),而低表達(dá)與化療療效增加相關(guān);在蛋白水平,研究發(fā)現(xiàn) ERCC-1低表達(dá)者比高表達(dá)者更能從化療中獲益,最新研究亦顯示ERCC-1陰性表達(dá)者提示對吉西他濱敏感;ERCC-1高表達(dá)與預(yù)后差顯著相關(guān)[6-8]。Olaussen等[9]報道稱 ERCC-1表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期無相關(guān)性,而與年齡、性別、病理類型及有無胸膜血管侵襲顯著相關(guān)。本研究對照組氣道上皮細(xì)胞100%陽性表達(dá) ERCC-1,而128例NSCLC中僅57例明顯陽性表達(dá),陽性率為44.53%,與文獻(xiàn)報道一致,表明ERCC-1表達(dá)降低或缺失可能與氣道上皮細(xì)胞癌變關(guān)系密切。在我們的研究結(jié)果中,ERCC-1表達(dá)與患者年齡、腫瘤分化程度及組織學(xué)類型相關(guān),年齡較大者 ERCC-1表達(dá)率較高,是否表明高齡患者可能對化療藥敏感性更差。高～中分化的腫瘤較低分化的腫瘤 ERCC-1陽性表達(dá)率高,是否可以解釋高分化癌對化療藥較不敏感。此外,我們的資料中肺鱗癌較之肺腺癌有更高的 ERCC-1陽性表達(dá)率,這與有些報道不一致,可能與觀察的病例數(shù)不同或患者人群的異質(zhì)性有關(guān)。

核糖核苷酸還原酶M1(ribonucleotide reductase subunit M1,RRM-1)是DNA合成通路中的限速酶,也是細(xì)胞存活的關(guān)鍵酶。RR包括2個亞單位:RRM-1和 RRM-2,RRM-1是核苷類似物系的化療藥物的結(jié)合位點。RRM-1基因定位于一個可出現(xiàn)于多種惡性腫瘤的雜合子丟失區(qū)域,有報道75%的NSCLC患者存在這樣的雜合性缺失,沒有這種雜合性缺失的患者比存在這種缺失的患者有更好的預(yù)后及更長的生存期。體內(nèi)外實驗研究表明RRM-1是吉西他濱療效的重要細(xì)胞決定因子。RRM-1陽性的NSCLC患者應(yīng)用吉西他濱化療藥物預(yù)后差[10]。本組研究觀察數(shù)據(jù)表明NSCLC組織中RRM-1的表達(dá)率較高,且與腫瘤大小、組織學(xué)類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等均無關(guān)而與患者年齡相關(guān),大于57歲的患者 RRM-1較多表達(dá),這與本組資料中ERCC-1的表達(dá)趨勢一致。

Ceppi等[11]研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC中 ERCC-1與RRM-1幾乎是同步的,具有相似的臨床意義,本文的數(shù)據(jù)分析也顯示了二者在蛋白水平上呈顯著正相關(guān)。

ERCC-1表達(dá)降低或缺失可能與NSCLC發(fā)生有關(guān);NSCLC組織中存在著ERCC-1與RRM-1的差異表達(dá),提示不同個體的NSCLC其生物學(xué)行為可能不同,因此檢測NSCLC組織中NER系統(tǒng)的表達(dá)情況對選擇NSCLC的個性化輔助化療及估計患者的預(yù)后有指導(dǎo)意義。

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Expression of ERCC-1 and RRM-1 and its relationship with clinical pathological characteristics in non-small cell lung cancer

Li Mingxian, Xia Chuansheng1, Li Naping＊

(Department ofPathology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,W uhan430030;1The Third District,NO.457Hospital of People’s L iberation A rmy,W uhan430012China)

Objective To investigate the expression of ERCC-1 and RRM-1 proteins of the nucleotide excision repair(NER)system in patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)and to analyze their correlations with the clinicopathological characteristics,providing a helpful experimental evidence for exploring NSCLC pathogenesis and resistance to chemotherapeutic drugs.Methods Immunohistochemical methods were used to investigate the expression of ERCC-1 and RRM-1 proteins in 128 cases of histopathologically defined NSCLC and 10 cases of bronchiectasis. Results 1. The positive expression rate of ERCC-1 and RRM-1 in NSCLC was 44.53%(57/128)and 75%(96/128),respectively.The different positive rates between NSCLC and control lung tissues had statistical significance. 2. The expression of ERCC-1 was related to age,histological type and tumor grade,but the expression of RRM-1 was related to age in patients with NSCLC. The relationship between ERCC-1 and RRM-1 was positive. Conclusion The reduction or lack of ERCC-1 expression may be significant in the pathogenesis of NSCLC.The expressions of ERCC-1 and RRM-1 were different in some individuals of NSCLC,indicating that the biological behavior may be different in them.It may be of great significance to detect the expression of the NER system in NSCLC for choosing the best adjuvant chemotherapy and estimating individual patient’s prognosis.

ERCC-1; RRM-1; NSCLC

R365

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.007

2010-11-18

2011-02-17

李明顯,男(1980年),漢族,碩士。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)