夏傳生 李娜萍吳純東 王義松 王書剛

(解放軍第457醫(yī)院三病區(qū),武漢 430012;1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院病理研究所,武漢 430030;2解放軍95825部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì),湖北孝感 432111)

TP、VEGF在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床病理研究

夏傳生 李娜萍1＊吳純東 王義松 王書剛2

(解放軍第457醫(yī)院三病區(qū),武漢 430012;1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院病理研究所,武漢 430030;2解放軍95825部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì),湖北孝感 432111)

目的 探討胸苷磷酸化酶(TP)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)及其與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué) EnVisionTM法檢測88例結(jié)直腸癌組織中 TP、VEGF的表達(dá),結(jié)合臨床病理特征進(jìn)行分析。結(jié)果 正常結(jié)直腸黏膜上皮不表達(dá) TP和VEGF;TP表達(dá)于結(jié)直腸癌細(xì)胞和(或)間質(zhì)內(nèi)單個核細(xì)胞,VEGF表達(dá)于癌細(xì)胞。TP和VEGF的陽性表達(dá)率分別為42.05%(37/88)和23.86%(21/88)。TP和VEGF在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Duke’sⅢ-Ⅳ期患者中的陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Duke’sⅠ-Ⅱ期患者(P<0.05);TP陽性表達(dá)率在癌組織浸潤至漿膜及漿膜外組高于浸潤程度較淺組(P<0.05)。結(jié)論 TP和VEGF的異常表達(dá)可能促進(jìn)結(jié)直腸癌的浸潤與轉(zhuǎn)移。

結(jié)直腸癌; TP; VEGF; 預(yù)后

血管形成是實(shí)體腫瘤得以生存、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是研究較早且較為深入的一種促血管生長因子。新近的研究表明,胸苷磷酸化酶(tyymidine phosphorylase,TP)在結(jié)構(gòu)和功能上與血小板源性內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(platelet-derived endothelial cell growth factor,PD-ECGF)一致 ,具有促進(jìn)血管生成的作用,在多種人類腫瘤組織中均有其表達(dá)水平增高,并與腫瘤的生物學(xué)行為及預(yù)后相關(guān)[1,2]。聯(lián)合分析 TP和VEGF的表達(dá)情況對于判斷一些惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后有一定意義。

結(jié)直腸癌是我國常見的消化道腫瘤,氟尿嘧啶類藥物是其輔助化療的基礎(chǔ)用藥。近年來的研究發(fā)現(xiàn)TP可以催化此類藥物在體內(nèi)代謝活化生成有抗癌活性的終產(chǎn)物[3]。本研究應(yīng)用免疫組化法聯(lián)合檢測結(jié)直腸癌組織中TP和VEGF這兩種血管生成誘導(dǎo)劑的表達(dá),分析它們與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系,旨在初步探討 TP、VEGF對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的可能影響,同時(shí)為臨床選擇結(jié)直腸癌的個性化治療及估計(jì)患者預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1. 材料

收集華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院和解放軍第457醫(yī)院胃腸外科2010年1月至2010年10月間經(jīng)手術(shù)切除,并經(jīng)病理診斷證實(shí)的原發(fā)性結(jié)直腸癌標(biāo)本88例。其中男50例,女38例;年齡18-82 歲 ,平均年齡 55.3 歲;按 Duke’s臨床分期:Ⅰ-Ⅱ期43例,Ⅲ-Ⅳ期45例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例。以30例手術(shù)切除結(jié)直腸癌標(biāo)本切緣正常結(jié)腸黏膜組織作為對照。患者臨床資料完整,術(shù)前未行任何放、化療。

2.主要試劑

VEGF(鼠抗人單克隆抗體,VG-1,即用型)購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;TP(鼠抗人單克隆抗體,P-GP,44C,工作濃度1∶50)、通用型二步法檢測試劑盒(PV-6000)和DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3.檢測方法

免疫組化 EnVisionTM二步法:組織標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定,石蠟包埋,連續(xù)4μm切片,常規(guī)脫蠟至水;高壓修復(fù)中火1min30s,流水沖洗冷卻至室溫,蒸餾水洗滌3次;3%H2O2避光滅活15min,PBS洗滌3次;一抗孵育1h,PBS洗滌3次;二抗孵育30min,PBS洗滌3次;DAB避光顯色3-5min,流水沖洗終止顯色;蘇木素復(fù)染1min,1%鹽酸酒精分化5秒,依次脫水透明后中性樹膠封固。以 PBS代替一抗作為陰性對照。

4.結(jié)果判斷

TP表達(dá)于結(jié)直腸癌癌細(xì)胞、癌組織間質(zhì)內(nèi)單個核細(xì)胞的胞質(zhì)和/或胞核;VEGF表達(dá)于癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),呈棕黃色或棕褐色著色。Olympus光學(xué)顯微鏡下對切片進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。每張切片在10×40倍視野下隨機(jī)選取4個視野,每個視野計(jì)數(shù)200個細(xì)胞,計(jì)算平均陽性細(xì)胞率。TP陽性結(jié)果判斷:>5%中到強(qiáng)著色或>50%弱著色判為癌細(xì)胞陽性;癌細(xì)胞間質(zhì)單個核細(xì)胞數(shù)>50%強(qiáng)著色判為間質(zhì)細(xì)胞陽性[4]。VEGF陽性結(jié)果判斷參照Bot[5]等的方法,以陽性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽性。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,全部計(jì)數(shù)資料均采用卡方檢驗(yàn),以 P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.TP的表達(dá)

TP在結(jié)直腸癌組織中的總體陽性表達(dá)率為42.05%(37/88),其陽性表達(dá)部位為癌細(xì)胞與間質(zhì)內(nèi)單個核細(xì)胞的胞質(zhì)和/或胞核,正常結(jié)腸黏膜上皮不表達(dá),差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1,圖1)。

2.VEGF的表達(dá)

VEGF在正常結(jié)腸黏膜不表達(dá),但結(jié)直腸癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見陽性表達(dá),陽性表達(dá)率為 23.86%(21/88),兩者差異具顯著性(P<0.05)(圖 2)。結(jié)直腸癌組織中VEGF的陽性表達(dá)率低于 TP表達(dá),差異具顯著性(表1)。

表1 TP、VEGF在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)Table 1 The expressions of TP and VEGF in colorectal cancer

3.TP、VEGF表達(dá)與各項(xiàng)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

TP、VEGF陽性表達(dá)率與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Duke’s分期有關(guān),即伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Duke’sⅢ-Ⅳ期患者中 TP、VEGF的陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及 Duke’sⅠ-Ⅱ期患者(P<0.05);TP 陽性表達(dá)率在癌組織浸潤至漿膜及漿膜外組高于浸潤程度較輕組(P<0.05)。TP、VEGF陽性表達(dá)率與患者年齡、性別、腫瘤大小及腫瘤分化程度均無關(guān)(表2)。

表2 TP、VEGF在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系Table 2 The relationship of TP and VEGF expressions with clinical pathological characteristics in colorectal cancer

討 論

結(jié)直腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,隨著人們生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的改變和壽命的提高,結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。結(jié)直腸癌患者確診時(shí)約30%一40%已為中晚期,即使早期病變也有約50%患者發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。近年來的研究報(bào)道,TP在多種人體惡性腫瘤中如乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、膀胱癌和肝癌等的表達(dá)異常增高[6]。結(jié)直腸癌組織中TP高表達(dá)的患者,組織中新生血管數(shù)目增多,容易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移并且預(yù)后不良[7]。TP作為促血管生長因子,是結(jié)直腸癌血管形成與維持的重要因子,對結(jié)直腸癌的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移起重要作用。因此,TP作為一個關(guān)鍵的因素而成為近年來研究結(jié)直腸癌靶向治療的主要目標(biāo)。

TP是胸腺嘧啶核苷合成和分解過程中的關(guān)鍵酶,其主要功能是催化胸腺嘧啶轉(zhuǎn)化為胸苷的可逆性反應(yīng),調(diào)節(jié)體內(nèi)胸苷水平。人 TP主要來源于血小板,也被稱為血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長因子,具有刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長以促進(jìn)腫瘤血管生成及抗細(xì)胞凋亡的特性,因而可以促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[8]。與VEGF等其他生長因子不同,TP不通過受體-配體途徑發(fā)揮作用,而是通過其酶活性產(chǎn)生相應(yīng)的產(chǎn)物而發(fā)揮促血管生成作用。TP催化胸苷得到的次級產(chǎn)物2-脫氧-D-核糖,在代謝過程中可產(chǎn)生大量的氧自由基,造成局部氧化應(yīng)激狀態(tài)并誘導(dǎo)VEGF、IL-8等血管活性因子表達(dá),最終通過各自的作用途徑促進(jìn)血管生成[9]。Tsujitani等的研究表明,TP陽性率與微血管密度(MVD)明顯相關(guān),TP陽性的胃癌MVD高于 TP陰性者[10]。抑制 TP的表達(dá)可抑制腫瘤的血管生成、腫瘤生長速度及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[1 1,1 2]。

本研究結(jié)果表明:42.05%(37/88)的結(jié)直腸癌組織內(nèi) TP表達(dá)陽性,23.86%(21/88)結(jié)直腸癌表達(dá)VEGF,而它們在正常結(jié)腸黏膜沒有或僅有微弱的表達(dá),提示它們對癌細(xì)胞來說可能是其代謝或生長所需要的物質(zhì)。VEGF在腫瘤中的促血管生成作用已使其成為抗腫瘤藥物作用的靶點(diǎn),但在我們的研究結(jié)果中其在結(jié)直腸癌的陽性表達(dá)率明顯低于TP的表達(dá),提示結(jié)直腸癌組織中的血管生成可能更依賴于TP,TP介導(dǎo)的血管生成可能是更多的結(jié)直腸癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的重要因素。通過對 TP、VEGF陽性結(jié)果與結(jié)直腸癌臨床病理特征的分析表明,兩者表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤分化均無明顯關(guān)系,但與腫瘤的浸潤程度、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高的臨床分期密切相關(guān),提示高表達(dá) TP和VEGF的腫瘤可能具有更惡的生物學(xué)行為。

5 -氟尿嘧啶是胃腸道癌的基礎(chǔ)化療藥物。近年來的研究表明,TP可催化抗嘧啶代謝藥5-FU與1-磷酸-2-脫氧核糖反應(yīng),產(chǎn)生5-氟-2-脫氧尿苷(5-F-2-dUR)參與5-FU在體內(nèi)的代謝過程,最終生成有抗癌活性的終產(chǎn)物;TP可以將氟尿嘧啶類前體藥物轉(zhuǎn)化為5-Fu,當(dāng) TP在腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)高時(shí),5-Fu的前體藥物(如卡培他濱)進(jìn)入患者體內(nèi)后在腫瘤組織中更容易轉(zhuǎn)化成5-Fu,這種瘤內(nèi)激活的治療方式具有一定靶向性[3,13],因而更為高效低毒。本研究結(jié)果表明TP在腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)明顯高于正常組織,但并非在所有病例均表達(dá),因此,檢測癌組織 TP的表達(dá)對于臨床合理選用化療藥物是必要的。綜合目前研究的結(jié)果,TP在惡性腫瘤中的表達(dá)具有雙刃劍作用,一方面其高表達(dá)與腫瘤的生長浸潤、轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后因素相關(guān),因此,TP抑制劑將有助于防止腫瘤血管形成和轉(zhuǎn)移;但另一方面 TP又為5-Fu前體藥物活化所必需,促進(jìn)腫瘤組織內(nèi) TP表達(dá)可以增強(qiáng)氟尿嘧啶類藥物的療效[14]。因此,如何有效地誘導(dǎo)或抑制 TP表達(dá)讓患者獲得最大利益還有待進(jìn)一步的研究。

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圖 版 說 明

圖1 TP在結(jié)直腸癌及正常結(jié)腸黏膜的表達(dá)a.TP在結(jié)直腸癌細(xì)胞的胞質(zhì)和(或)胞核及間質(zhì)細(xì)胞陽性表達(dá);b.正常結(jié)腸黏膜腺體上皮細(xì)胞 TP陰性,間質(zhì)細(xì)胞陽性表達(dá)?！?00;EnVisionTM

圖2 VEGF在結(jié)直腸癌及正常結(jié)腸黏膜的表達(dá) a.VEGF在結(jié)直腸癌細(xì)胞胞質(zhì)陽性表達(dá);×400 b.正常結(jié)腸黏膜VEGF陰性。×200;EnVisionTM

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 The expression of TP in colorectal cancer and normalcolorectal mucosa. A. The positive TP expression in the cancer cells cytoplasm and/or nucleus. B. The negative expression of TP in the normal colorectal mucosa.×200;EnVisionTM

Fig.2 The expression of VEGF in colorectal cancer cells and normal colorectal mucosa. A. The positive VEGF expression in the cancer cells cytoplasm. ×400 B. The negative VEGF expression in the normal colorectal mucosa. ×200;EnVisionTM

The expression of TP,VEGF and its relationship with clinical Pathological significance in Colorectal Cancer

Xia Chuansheng,Li Naping1＊,Wu Chundong,Wang Yishong,Wang Shugang2

Objective To investigate the expression of thymidine phosphorylase(TP)and vascular endothelial growth factor(VEGF)and its relationship with clinical pathological charucteristies of colorectal cancer.Methods Immunohistochemical staining method EnVisionTMwas used to investigate the expression of TP and VEGF in 88 cases of colorectal cancer and its relationship with clinical pathology.Results TP and VEGF were not expressed in normal colorectal mucosa,but TP expression in cancer tissue was observed in both cancer cells and(or)single nucleus cells of the mesenchyme.VEGF expression in cancer tissue was observed in the cancer cells. The positive expression rate of TP and VEGF was 40.05%(37/88)and 23.86%(21/88)respectively in colorectal cancer. Higher in the cases of lymph node metastasis and Duke’s Ⅲ-Ⅳthan in those without lymph node metastasis and Duke’s Ⅰ-Ⅱ(P<0.05). The positive expression rate of TP was higher in the cancer tissue invading the serosa and beyond(P<0.05). Conclusion The anomalous expression of TP and VEGF in colorectal cancer may promote the invasion and metastasis of colorectal cancer.

Colorectal Cancer; TP; VEGF; Prognosis

R734

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.016

2010-12-10

2011-02-03

夏傳生,男(1957年),漢族,副主任醫(yī)師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)

(The Third Dept,NO. 457Hospital ofPeople’s L iberation A rmy,W uhan430012;1Department ofPathology,Tong J i Hospital,Tong J i Medical College,Huazhong University of Science and Technology,W uhan4300302NO. 95825A rmy S anitation B and ofPeople’s L iberation A rmy,Hubei Xiaogan432111,China)