徐雪晶 杜廣勝 洪李峰 賀 莉 馬業(yè)新

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院心內(nèi)科,湖北武漢 430030)

NF-κB介導(dǎo)非對稱性二甲基精氨酸上調(diào)大鼠主動脈誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達

徐雪晶 杜廣勝 洪李峰 賀 莉 馬業(yè)新＊

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院心內(nèi)科,湖北武漢 430030)

目的 探討非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)上調(diào)大鼠主動脈誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達是否是通過激活NF-κB實現(xiàn)的。方法 Wistar大鼠50只隨機分為四組:①對照組(n=10):標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。②H組(n=12):高脂飼料喂養(yǎng)。③A+H組(n=14):予ADMA[0.2mg/kgd]灌胃,高脂飼料喂養(yǎng)。④P+A+H組(n=14):予吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)[40mg/kgd]腹腔注射、ADMA[0.2mg/kgd]灌胃、高脂飼料喂養(yǎng)。對照組、H組予等體積的生理鹽水灌胃及腹腔注射、A+H組給予等體積的生理鹽水腹腔注射。18周后麻醉大鼠、取主動脈。以實時熒光定量PCR和Westen blotting分別檢測iNOS mRNA和蛋白表達,以電泳遷移率變動分析(EMSA)和增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測NF-κB活性。結(jié)果 ①A+H組iNOS mRNA和蛋白表達量較對照組和 H組增加(P<0.05),P+A+H組較A+H組iNOS mRNA和蛋白表達量降低(P<0.05)。②A+H組NF-κB活性較對照組和 H組顯著升高(P<0.05),P+A+H組NF-κB活性較A+H組明顯降低(P<0.05)③相關(guān)分析:NF-κB活性與iNOS mRNA和蛋白表達量呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r分別為0.854、0.876,P<0.05)。結(jié)論 ADMA可能通過激活NF-κB途徑上調(diào)iNOS表達,從而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。

核因子-κB; 非對稱性二甲基精氨酸; 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶; 動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化是一種多因素疾病,其中高血脂、高血壓和糖尿病是最為重要的危險因素,血漿非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)水平在動脈粥樣硬化患者及具有動脈粥樣硬化危險因素患者體內(nèi)都明顯增高[1-3]。ADMA是內(nèi)皮源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的競爭性抑制劑,正常低濃度的ADMA不足以抑制NOS活性。當(dāng)ADMA在血中濃度過高,便會抑制NOS活性,導(dǎo)致NO產(chǎn)生減少,削弱了NO的舒血管及抗動脈粥樣硬化效應(yīng)。ADMA可通過誘發(fā)氧化應(yīng)激[4-6]、誘導(dǎo)多種炎癥因子生成[7]、促進平滑肌細胞凋亡[8]而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。ADMA亦可增強巨噬細胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)基因和蛋白的表達,促進巨噬細胞轉(zhuǎn)化為泡沫細胞[9]。iNOS基因表達主要在轉(zhuǎn)錄水平上進行,其5’端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)含有NF-κB結(jié)合位點[10],而 NF-κB是普遍存在于胞漿中的一種應(yīng)激反應(yīng)因子,能與多種細胞基因的啟動子或增強子κB位點發(fā)生特異性結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄。因此,我們提出假設(shè):ADMA可能通過激活 NF-κB而上調(diào)iNOS表達。本研究以健康Wistar大鼠為研究對象,分組干預(yù),對比觀察ADMA對大鼠主動脈iNOS、NF-κB表達的影響、探討NF-κB活性與iNOS表達之間的關(guān)系。

材料和方法

1 材料 健康雄性Wistar大鼠(SPF級)50只,210.5g±40.6g,購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院動物實驗中心,許可證號:SCXK(鄂)2008-0005。膽固醇、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司),ADMA、PDTC(Sigma),TRIzol Rengent(invitrogen公司),SYBR Green real-time PCR Master mix(TOYOBO公司),LightShiftTMChemiluminescentEMSA Kit(PIERCE公司),兔抗 iNOS多克隆抗體(Santa Cruz),SLAN全自動實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(上海宏石醫(yī)療科技有限公司),酶標(biāo)儀(BIO-TEK公司),Quantity One軟件(Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分組及干預(yù)措施 50只健康雄性大鼠隨機分為四組,①對照組(n=10):予標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng);②H組根據(jù)文獻[11]給予高脂飼料,即3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、10%蛋黃粉和71.3%標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料;③A+H 組:ADMA[0.2mg/kgd]灌胃 ,高脂飼料喂養(yǎng);④P+A+H組:PDTC[40mg/kg/d]腹腔注射、ADMA[0.2mg/kg/d]灌胃 ,高脂飼料喂養(yǎng)。對照組、H組均予等體積生理鹽水灌胃及腹腔注射,A+H組予等體積的生理鹽水腹腔注射。除對照組外,其余三組在喂養(yǎng)開始時按體重一次性腹腔注射維生素D30.6MIU/kg[11],對照組注射等體積的生理鹽水。飼養(yǎng)18周。

2.2 取材 以30%烏拉坦(1.5g/kg)腹腔注射麻醉大鼠,自主動脈根部至髂動脈分支處剝離主動脈全長,去除血管外脂肪,用4℃生理鹽水沖洗干凈,以濾紙吸去水分,迅速投入液氮中,4h后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

2.3 Real-Time PCR檢測iNOS mRNA表達引物均由Invitrogen公司合成。Trizol法提取組織總RNA,測 RNA濃度;按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;熒光定量 PCR反應(yīng)。iNOS引物序列:Sense:5’-TCA GCA CAG AGG GCT CAA AC-3’,Antisense:5’-ACA TCG CCA CAA ACA TAA AGG-3’,擴增片段255bp。內(nèi)參 Actin引物序列:Sense:5’-CGT TGA CAT CCG TAA AGA CCT C-3’,Antisense:5’-TA G GAG CCA GGG CAG TAA TCT-3’;擴增片段 110bp。反應(yīng)總體系 25μl:SYBR Green mix 12.5μl、Plus solution 2.5μl、Primer mix 2μl、去離子水 5.5μl、cDNA 2.5μl。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 2min后,95℃變性15s,57℃退火15s,72℃延伸 45s,共 40次循環(huán),最后于72℃延伸10min。在同一次反應(yīng)中,各組均設(shè)3個平行重復(fù)。每個循環(huán)后采集熒光生成擴增曲線。反應(yīng)結(jié)束后,設(shè)定閾值,軟件輸出Ct值;根據(jù)比較Ct值法公式,獲得不同組間基因表達比值,具體公 式 為 :2-ΔΔCt, 其 中 Δ ΔCt = (Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

2.4 Westen blot檢測iNOS蛋白表達 按試劑盒說明書提取組織總蛋白,按BCA法測定蛋白濃度。以每泳道40-50g上樣,經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,1:200一抗4℃孵育過夜,1:3000二抗室溫孵育3h,ECL試劑室溫孵育2-5min,曝光10s,照相并分析,以Actin蛋白表達為內(nèi)參照,用iNOS與Actin條帶的灰度比表示iNOS蛋白相對表達量。

2.5 電泳遷移率變動分析(EMSA)和增強化學(xué)(ECL)檢測NF-κB活性:按試劑盒說明書提取細胞核蛋白,Bradford法測定蛋白濃度。生物素標(biāo)記NF-κB P65亞基單鏈寡核苷酸探針序列:5’Biotin-…AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C …-3’,3’-…TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G…-Biotin 5’。5-10 g巨噬細胞核蛋白提取物與標(biāo)記DNA探針在20 l(10×binding buffer、50%glycerol、1%NP-40、1M KCL 、100mM MgCl2、200mM EDTA 、Biotin-DNA 0.2mol/l)反應(yīng)液、1g/l poly[d(I-C)]中室溫放置20min。反應(yīng)混合物在終濃度為6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上4℃、180V電泳40min,電泳緩沖液用預(yù)冷的0.5×TBE。電泳結(jié)束后,將凝膠轉(zhuǎn)移至帶正電荷的尼龍膜上,在380mA電流強度下作用30min。轉(zhuǎn)膜完成后將膜于紫外燈下30cm處作用20分鐘交聯(lián),然后進行封閉、抗體孵育、洗脫、平衡后發(fā)光。在暗室中曝光2-5min后,顯影、定影。Quantity One軟件進行分析。

結(jié) 果

1 大鼠主動脈iNOS mRNA表達的比較:圖1

圖1 Real-time PCR檢測各級iNOS mRNA的表達Fig.1 The mRNA expression of iNOS detected by realtime PCR.

與對照組比較,A+H組iNOS mRNA表達明顯升高(P<0.05);也明顯高于 H組(P<0.05);P+H+A組iNOS mRNA較A+H組明顯降低,二者相比差異有顯著性(P<0.05)。提示ADMA能增強大鼠主動脈iNOS mRNA表達,而NF-κB特異性抑制劑PDTC可明顯抑制ADMA的這一效應(yīng)。

2.2 大鼠主動脈iNOS蛋白表達的比較:圖2

與對照組比較,A+H組iNOS蛋白表達量明顯增加(P<0.05),也明顯高于 H 組(P<0.05);而P+A+H組iNOS蛋白表達量較A+H組明顯減弱,差異有顯著性(P<0.05)。表明ADMA能促進大鼠主動脈iNOS蛋白表達,而PDTC可明顯抑制ADMA的這一作用。

2.3 大鼠主動脈NF-κB活性的比較 圖3

A+H 組(9083.87 ±586.36)NF-κB 活性較對照組 (6341.95 ±510.82)和 H 組 (7027.63 ±320.57)明顯升高,兩組間比較差異均有顯著性(P<0.05);P+A+H 組 (4709.13 ±362.40)NF-κB活性較 A+H組明顯降低(P<0.05)。提示ADMA可進一步激活NF-κB。

圖2 Westen blot檢測各組iNOS蛋白表達Fig.2 The protein expression of iNOS detected by westem blom.

圖3 EMSA檢測各組NF-κB活性Fig. 3 The NF-κB activity detected by EMSA

2.4 相關(guān)分析

各組NF-κB活性與iNOS mRNA及蛋白表達量的相關(guān)分析顯示:NF-κB活性與iNOS mRNA及蛋白表達量均呈顯著正相關(guān)(r=0.854,0.876;P<0.05)。

討 論

iNOS為一種鈣離子非依賴型誘生型酶,在正常生理狀態(tài)下表達較低甚或不表達,但在受到各種刺激如外來抗原、細胞因子等誘導(dǎo)活化時,可合成大量NO;iNOS主要通過生成NO而發(fā)揮其生物學(xué)作用。高水平的NO除具有炎癥介質(zhì)和氧自由基的性質(zhì)外,NO還能與超氧陰離子產(chǎn)生氧化性很強的自由基-過氧化亞硝酸鹽(ONOO-)[12],后者可氧化修飾脂質(zhì)、損傷血管,促進AS的發(fā)生發(fā)展及斑塊破裂[13]。iNOS表達調(diào)控最重要的是在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié),而且在iNOS基因序列的5’端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)含有NF-κB結(jié)合位點,NF-κB激活參與iNOS mRNA表達,且為iNOS表達的必需條件[14]。NF-κB是一種具有基因轉(zhuǎn)錄多項調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子,廣泛存在于各種細胞中。研究發(fā)現(xiàn)NF-κB能夠促進細胞凋亡、破壞血管內(nèi)皮細胞層的完整性、促使吞噬脂質(zhì)的單核巨噬細胞侵入及平滑肌細胞的增值[15,16]遷移,促進脂質(zhì)斑塊的形成。近年來的許多研究表明,參與粥樣硬化斑塊形成中炎癥反應(yīng)的相關(guān)基因多為NF-κB的靶基因,由NF-κB信號通路調(diào)控其轉(zhuǎn)錄表達。

本研究結(jié)果顯示:在動脈粥樣硬化病變形成過程中,ADMA無論在基因水平還是蛋白水平上均可明顯上調(diào)大鼠主動脈iNOS表達,同時增強NF-κB活性;但給予在NF-κB特異性抑制劑PDTC預(yù)處理后,ADMA增強NF-κB活性及上調(diào)iNOS表達這一效應(yīng)明顯被抑制;相關(guān)分析進一步顯示NF-κB活性與iNOS表達均呈顯著正相關(guān)。這一實驗結(jié)果揭示了ADMA上調(diào)iNOS表達是由 NF-κB介導(dǎo)的,抑制NF-κB活性可減少iNOS表達,從而減輕動脈粥樣硬化病變程度。因此,我們推測在動脈粥樣硬化過程中,血漿中升高的ADMA通過激活NF-κB而上調(diào)iNOS表達,iNOS表達增加產(chǎn)生大量NO,后者除作為信使分子參與血管壁的炎癥反應(yīng)外,還與超氧陰離子反應(yīng)生成過氧化亞硝酸鹽,后者分解成反應(yīng)性更強的羥自由基,促進脂質(zhì)過氧化,從而加速血管損傷和AS病變程度。

因本研究只觀察了NF-κB對ADMA誘導(dǎo)大鼠主動脈表達iNOS的影響,未涉及ADMA激活NF-κB后下游其他產(chǎn)物,如 TNF-α是否變化及其對表達iNOS的影響,以及NF-κB上游的抑制蛋白及可能存在更高水平蛋白酶的調(diào)節(jié)等問題,所以其中的機制及關(guān)系仍需深入研究。

[1]Paiva H,Laakso J,Laire H,et al.Plasma asymmetric dimethylarginine and hyperemic myocardial blood flow in young subjects with borderline hypertension or familial hypercholesterolemia. J Am Coll Cardiol,2002. 40(7):1241-1247

[2]Lin KY,Ito A,Asagami T,et al.Impaired nitric oxide synthase pathway in diabetes mellitus:role of asymmetric dimethylarginine and dimethylarginine dimethylaminohydrolase. Circulation,2002. 106(8):987-992

[3]王洪巨,劉俊,史曉俊等,血漿非對稱性二甲基精氨酸濃度與急性冠狀動脈綜合征的關(guān)系.臨床心血管病雜志,2008.24(2):106-108

[4]Jia SJ,Jiang DJ,HU CP,et al.Lysophosphatidylcholine-induced elevation of asymmetric dimethylarginine level by the NADPH oxidase pathway in endothelial cells. Vascul Pharmacol,2006.44(3):143-148

[5]Jiang DJ,Jia SJ,Dai Z,et al.Asymmetric dimethylarginine induces apoptosis via p38 MAPK/caspase-3-dependent signaling pathway in endothelial cells.J Mol Cell Cardiol,2006.40(4):529-539

[6]Pope AJ,Drunanl,Guzman J E,et al.Role of DDAH-1 in lipid peroxidation product-mediated inhibition of endothelial NO generation. Am J Physiol Cell Physiol,2007.293(5):1679-1686

[7]Konukoglu D,Firtina S,Serin O.The relationship between plasma asymmetrical dimethyl-L-arginine and inflammation and adhesion molecule levels in subjects with normal,impaired,and diabetic glucose tolerance.Metabolism,2008.57(1):110-115

[8]Yuan Q,Jiang DJ,Chen QQ,et al.Role of asymmetric dimethylarginine in homocysteine-induced apoptosis of vascular smooth muscle cells.Biochem Biophys Res Commun,2007.356(4):880-885

[9]何軍,馬業(yè)新.非對稱性二甲基精氨酸促進大鼠腹腔巨噬細胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達.臨床心血管病雜志,2007.23(4):280-283

[10]Cooke CL,Davidge ST.Peroxynitrite increases iNOS through NF-kappaB and decreases prostacyclin synthase in endothelial cells.Am J Physiol Cell Physiol,2002.282(2):395-402

[11]楊鵬遠,芮耀誠,焦亞斌.動脈粥樣硬化大鼠實驗?zāi)Ｐ偷慕?第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2003.24(7):802-804

[12]Dulak J,Jazkowicz A,Dembinska-Kiec A,et al.Nitric oxide induces thesynthesis ofvascular endothelial growth factor by rat vascular smooth muscle cells.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000.20(3):659-666

[13]Niu XL,Yang X,Hoshiaik,et al.Inducible nitric oxide synthase deficiency does not affect the susceptibility of mice to atherosclerosis but increases collagen content in lesions. Circulation,2001. 103(8):1115-1120

[14]Jiang B,Xu S,Hou X,et al.Temporal control of NF-kappaB activation by ERK differentially regulates interleukin-1beta-induced gene expression.J Biol Chem,2004.279(2):1323-1329

[15]Cui R,Tieu B,Recina A,et al.RhoA mediates angiotensin II-induced phospho-Ser536 nuclear factor kappaB/RelA subunit exchange on the interleukin-6 promoter in VSMCs. Circ Res,2006. 99(7):723-730

[16]Cai W,Ruan LM,Wang YN,et al.Effects of angiotensin II on connexin 43 of VSMCs in arteriosclerosis.J Zhejiang Univ Sci B,2006.7(8):648-653

NF-κB mediates upregulation of inducible nitric oxide synthase expression in rat aortas by asymmetric dimethylarginine

Xu Xuejing,Du Guangsheng,Hong Lifeng,He Li,Ma Yexin＊

(Department of Cardiology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,
Huazhong University of Science and Technology,Hubei W uhan430030,China)

Objective To investigate,whether the asymmetric dimethylarginine(ADMA)upregulated expression of iNOS in rat aortas is modulated by nuclear factor kappa B(NF-κB). Methods 50 Wistar rats were randomly divided into 4 groups:①Control group(n=10)fed with standard diet. ②H group(n=12)fed with high fat diet. ③A+H group(n=14)administered intergastrically with ADMA[0.2mg/kgd],and fed with high fat diet. ④P+A+H group(n=14)given interperitoneal injection of pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)[40mg/kgd],administered intergastrically with ADMA[0.2mg/(kgd)],and fed with high fat diet.Both control and H groups were administered intergastrically and injected interperitoneally with the same volume of normal saline.The A+H group was injected interperitoneal,with the same volume of normal saline. 18 weeks later,the rats were anesthetized,and aortas were gathered. The mRNA and protein expressions of iNOS were detected with real time fluorescent quantitative PCR(real-time PCR)and Westen Blotting respectively. The activity of NF-κB was detected with electrophorestic mobility shift assay(EMSA)and enhanced chemiluminescent(ECL)technique. Results ①The mRNA and protein expressions of iNOS in the A+H group were higher than those in control and H groups(P<0.05)decreased in P+A+H group than in the A+H group(P<0.05). ②The NF-κB activity in the A+H group was extremely higher than in control and H groups(P<0.05);significantly lower in the P+A+H group than in the A+H group(P<0.05). ③ The activity of NF-κB was positively correlated with the mRNA and protein expression of iNOS(P<0.05). Conclusion ADMA upregulates the iNOS expression through the NF-κB activity pathway in rat aortas,which might be one of the mechanisms of atherosclerosis.

Nuclear factor-κB; Asymmetric dimethylarginine; Inducible nitric oxide synthase;Atherosclerosis

R329

A

10.3870/zgzzhx.2011.01.015

2010-07-10

2010-12-01

徐雪晶,女(1979年),漢族,博士研究生。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)