溫明顯，王成濤，趙 磊，楊雪蓮，尹麗麗，童軍茂

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832003；2.北京工商大學(xué)食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京100048；3.北京工商大學(xué)食品風(fēng)味化學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048）

正己烷反應(yīng)體系中酶法轉(zhuǎn)化乙酸3-甲硫基丙醇酯的工藝條件

溫明顯1，2，王成濤2，3，*，趙 磊2，3，楊雪蓮2，3，尹麗麗2，3，童軍茂1

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832003；2.北京工商大學(xué)食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京100048；3.北京工商大學(xué)食品風(fēng)味化學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048）

研究了脂肪酶催化合成天然香料乙酸3-甲硫基丙醇酯（EMTP）的關(guān)鍵因素及條件。以發(fā)酵3-甲硫基丙醇、乙酸為主要原料酶法合成EMTP的反應(yīng)中，固定化Novozym 435脂肪酶為最佳催化劑，正己烷作為溶劑有利于提高酶活力；在正己烷反應(yīng)體系中，Novozym435用量、分子篩吸水劑用量、乙酸加入次數(shù)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)EMTP合成有重要的影響，添加Novozyme435 50mg、分子篩2g、反應(yīng)溫度40℃、乙酸分3次加入、搖瓶速率100～150r/min，反應(yīng)30h為較佳的反應(yīng)條件，其EMTP產(chǎn)量為6.5mg/mL。

3-甲硫基丙醇，乙酸，乙酸3-甲硫基丙醇酯，脂肪酶非水相轉(zhuǎn)化，正己烷反應(yīng)體系

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙酸3-甲硫基丙醇酯、乙酸（發(fā)酵來(lái)源） 國(guó)藥化學(xué)試劑公司；正己烷、叔丁醇、正庚烷、丙酮 分析純，北京化學(xué)試劑公司；Novozym 435、Lipozyme TL 100L、Greasex 200 MG、Lipopan 50 BG、NovoCor ADL、Lipozyme TL 1M、Lipex 100T 丹麥諾維信公司；3-甲硫基丙醇 本課題組發(fā)酵法制備。

LC-20A型島津高效液相色譜儀 島津國(guó)際貿(mào)易有限公司；HQ45恒溫?fù)u床 中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；DF-101S磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 3-甲硫基丙醇、乙酸3-甲硫基丙醇酯的液相色譜測(cè)定 液相色譜條件：LC-20A島津液相色譜儀、色譜柱ODS-SP、二極管陣列檢測(cè)器（4.6×150mm）；流動(dòng)相：甲醇∶水=60∶40，柱溫為室溫，進(jìn)樣量20μL。3-甲硫基丙醇和乙酸3-甲硫基丙醇酯在此條件下其保留時(shí)間分別為4.1、16.35min。

配制系列3-甲硫基丙醇、乙酸3-甲硫基丙醇酯的甲醇溶液，液相色譜儀檢測(cè)，繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 脂肪酶篩選 將3-甲硫基丙醇1mL和乙酸0.6mL分批次加入反應(yīng)容器中，分別加入NovoCor ADL、Lipozyme TL 100L、Greasex 200 MG、Lipopan 50 BG、Lipozyme TL 1M、Lipex 100T各0.01mL以及Novozyme 435 0.05g，于溫度45℃、搖床轉(zhuǎn)速150r/min、密封反應(yīng)6h，反應(yīng)物液相色譜法測(cè)定乙酸3-甲硫基丙醇酯轉(zhuǎn)化率。

1.2.3 溶劑篩選 分2～3次將0.6mL乙酸，1mL 3-甲硫基丙醇分別加入到10mL正己烷、丙酮、正庚烷、叔丁醇溶液體系中，50mg Novozyme 435、溫度45℃、搖床轉(zhuǎn)速150r/min、密封反應(yīng)6h，反應(yīng)物液相色譜法測(cè)定乙酸3-甲硫基丙醇酯轉(zhuǎn)化率。

1.2.4 多種因素條件對(duì)乙酸3-甲硫基丙醇酯合成反應(yīng)的影響 在正己烷體系加有1mL 3-甲硫基丙醇，0.6mL乙酸反應(yīng)容器中，分別考察乙酸加入次數(shù)、反應(yīng)溫度、Novozym435酶用量、分子篩用量、反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)乙酸3-甲硫基丙醇酯轉(zhuǎn)化率的影響，反應(yīng)物用液相色譜法測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同脂肪酶和有機(jī)溶劑對(duì)乙酸3-甲硫基丙醇酯合成反應(yīng)的影響

選擇來(lái)源于丹麥諾維信公司的7種脂肪酶Novozym 435、Lipozyme TL 100L、Greasex 200 MG、Lipopan 50 BG、NovoCor ADL、Lipozyme TL 1M、Lipex 100T為催化劑，以發(fā)酵3-甲硫基丙醇、乙酸為主要原料，分別考察在無(wú)溶劑和有機(jī)溶劑體系中乙酸3-甲硫基丙醇酯產(chǎn)量。圖1結(jié)果表明，在無(wú)溶劑和有機(jī)溶劑2類(lèi)反應(yīng)體系中，考察的7種脂肪酶中固定化Novozyme 435催化合成EMTP產(chǎn)量都為最高，其他脂肪酶的催化產(chǎn)量很低，甚至低于3-甲硫基丙醇與乙酸直接混合的反應(yīng)體系中EMTP產(chǎn)量（空白）；所實(shí)驗(yàn)的4種有機(jī)溶劑體系中，正己烷體系EMTP產(chǎn)量為最高，丙酮體系產(chǎn)量為最低；采用無(wú)溶劑反應(yīng)體系EMTP產(chǎn)量為4.25mg/mL。本文重點(diǎn)闡述正己烷反應(yīng)體系中因素條件對(duì)EMTP轉(zhuǎn)化的影響，無(wú)溶劑體系中因素條件對(duì)EMTP轉(zhuǎn)化的影響將另文說(shuō)明。

圖1 4種有機(jī)溶劑反應(yīng)體系中不同脂肪酶對(duì)EMTP合成反應(yīng)的影響

2.2 乙酸分批加入次數(shù)對(duì)EMTP合成反應(yīng)的影響

以選定的Novozyme 435為催化劑，在正己烷反應(yīng)體系中考察乙酸分批加入次數(shù)對(duì)EMTP轉(zhuǎn)化率的影響。圖2結(jié)果表明，乙酸分3～4次加入時(shí)產(chǎn)物EMTP轉(zhuǎn)化率為最高，其產(chǎn)量約為1.5mg/mL，而1次性加入乙酸時(shí)產(chǎn)物EMTP產(chǎn)量約為0.28mg/mL，說(shuō)明乙酸添加次數(shù)對(duì)脂肪酶的催化活性和產(chǎn)物EMTP的產(chǎn)量有重要影響，分析其原因可能是乙酸的量會(huì)影響反應(yīng)體系pH及其微環(huán)境，進(jìn)而影響Novozyme 435的催化活性。

圖2 乙酸加入次數(shù)對(duì)EMTP合成反應(yīng)的影響

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)EMTP合成反應(yīng)的影響

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)EMTP合成反應(yīng)的影響

溫度對(duì)酶的催化活性及效率有重要影響，一般高溫有利于酶促反應(yīng)速度，但高溫會(huì)降低酶的穩(wěn)定性，進(jìn)而降低酶的使用次數(shù)。以Novozyme 435為催化劑，研究正己烷反應(yīng)體系中反應(yīng)溫度對(duì)EMTP合成反應(yīng)的影響。圖3結(jié)果表明，反應(yīng)溫度對(duì)脂肪酶催化活性有較大影響，反應(yīng)溫度為40～45℃時(shí)產(chǎn)物乙酸3-甲硫基丙醇酯產(chǎn)量最高，約為1.28mg/mL。

2.4 加酶量對(duì)EMTP合成反應(yīng)的影響

由圖4可看出正己烷反應(yīng)體系中脂肪酶的用量對(duì)EMTP合成反應(yīng)及催化活性的影響，脂肪酶加入量50mg時(shí)，其產(chǎn)物乙酸3-甲硫基丙醇酯產(chǎn)量約為1.30mg/mL，繼續(xù)增加脂肪酶用量其產(chǎn)量無(wú)明顯提高。

圖4 脂肪酶用量對(duì)EMTP合成反應(yīng)的影響

2.5 分子篩加入量對(duì)EMTP合成反應(yīng)的影響

正己烷反應(yīng)體系中分子篩加入量對(duì)EMTP合成反應(yīng)的影響見(jiàn)圖5，結(jié)果表明，分子篩添加量對(duì)脂肪酶催化活性及EMTP合成反應(yīng)有重要影響，尤其是在分子篩用量＜2g時(shí)，其產(chǎn)物EMTP產(chǎn)量較低，用量≥2g時(shí)EMTP產(chǎn)量有較大提高，達(dá)到4.60mg/mL以上。分析其原因，3-甲硫基丙醇、乙酸為底物的酯化反應(yīng)是一個(gè)產(chǎn)生水的可逆反應(yīng)，酯化反應(yīng)和水解反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，加入分子篩吸水劑，有利于酯化反應(yīng)的進(jìn)行，因此分子篩吸水劑的添加量對(duì)非水相條件脂肪酶催化活性及轉(zhuǎn)化率有重要影響，適量添加吸水劑有利于提高EMTP的轉(zhuǎn)化率。

圖5 分子篩用量對(duì)EMTP合成反應(yīng)的影響

2.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)EMTP合成反應(yīng)的影響

正己烷反應(yīng)體系中添加固定化Novozyme 435 50mg、分子篩2g、反應(yīng)溫度40℃、乙酸分3次加入、100～150r/min搖瓶速率是較好的反應(yīng)條件（圖6），在此條件下研究無(wú)溶劑反應(yīng)體系中反應(yīng)時(shí)間為30h時(shí)，產(chǎn)物EMTP產(chǎn)量約為6.5mg/mL，轉(zhuǎn)化率約為11.0%。

3 結(jié)論

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)EMTP合成反應(yīng)的影響

以發(fā)酵3-甲硫基丙醇和乙酸為主要原料脂肪酶轉(zhuǎn)化合成EMTP是可行的。固定化Novozym 435脂肪酶是最佳催化劑，正己烷作為溶劑有利于提高酶活力和合成反應(yīng)；在正己烷反應(yīng)體系中Novozym435用量、分子篩吸水劑用量、乙酸加入次數(shù)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等是關(guān)鍵因素條件，對(duì)EMTP產(chǎn)量及酶活力有重要影響；在正己烷體系中優(yōu)化后反應(yīng)的條件為：添加Novozyme 435 50mg、分子篩2g、反應(yīng)溫度40℃、乙酸分3次加入、搖瓶速率100～150r/min，反應(yīng)30h，在此條件下EMTP產(chǎn)量為6.5mg/mL。

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Preparation of natural aroma ethyl-3-methyl-thiopropionate（EMTP）from biocatalysis reaction in normal hexane system

WEN Ming-xian1,2,WANG Cheng-tao2,3，*,ZHAO Lei2,3,YANG Xue-lian2,3,YIN Li-li2,3，TONG Jun-mao1
（1.College of Food,Shihezi University,Shihezi 832003,China；2.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048，China；3.Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China）

The production of natural aroma ethyl-3-methyl-thiopropionate (EMTP)by biocatalytic synthesis in non-aqueous system was studied.The results indicated that the best catalyst dosage was immobilized lipase Novozym435，and normal hexane as solvent was helpful to improve the activity of lipase in the reaction system. the amount of Novozym435，molecular sieve，the added times of acetic acid，reaction temperature，reaction time were important factors on the EMTP synthesis.And the optimal conditions in normal hexane medium were that lipase 50mg，molecular sieve 2g，reaction temperature 40℃，reaction time 30h，three times of acetic acid added，shaked speed 150r/min.The production rate of EMTP reached 6.5mg/mL under the optimized operation conditions.

methionol；acetic acid；ethyl-3-methyl-thiopropionate；lipase-catalyzed synthesis；normal hexane reaction system

TS201.2

B

1002-0306（2011）10-0212-03

乙酸3-甲硫基丙醇酯（Ethyl-3-methylthiopropionate，EMTP）天然存在于菠蘿、西瓜、鴨梨、啤酒、葡萄酒、威士忌和白蘭地中[1-4]；在氨基酸生物降解過(guò)程中，也產(chǎn)生少量的EMTP[5]。EMTP具有濃烈的菠蘿特征香味，是調(diào)配菠蘿、柑橘、辣根、番茄、洋蔥、豬肉、牛肉、雞肉、巧克力等多種果味香精、肉味香精和酒用香精的常用香料[1，3]。目前含硫酯類(lèi)香料主要通過(guò)化學(xué)合成生產(chǎn)，反應(yīng)需要高溫酸堿催化，反應(yīng)條件苛刻，能耗高環(huán)境污染嚴(yán)重[6-7]。脂肪酶（Lipase，EC 3.1.1.3.）是一類(lèi)特殊的酯鍵水解酶，不僅能催化甘油脂肪酸酯水解，還能催化酯類(lèi)物質(zhì)合成或轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。非水相體系中脂肪酶可催化合成酯類(lèi)香料，反應(yīng)條件溫和，可增加有機(jī)底物的溶解性，改變反應(yīng)的平衡方向，提高反應(yīng)的立體選擇性，抑制水參與的副反應(yīng)，易于消除底物和產(chǎn)物的抑制作用等，成為重要的綠色化學(xué)主要技術(shù)之一[6，8]。生物轉(zhuǎn)化制備的香料，其構(gòu)型、手性單一，有助于香氣品質(zhì)的提高，是近年來(lái)天然香料制備的重要發(fā)展方向[9-12]。本文以發(fā)酵3-甲硫基丙醇和發(fā)酵冰醋酸為主要原料，以脂肪酶為催化劑，研究天然乙酸3-甲硫基丙醇酯的生物轉(zhuǎn)化，優(yōu)化其非水相條件。

2011-08-02 *通訊聯(lián)系人

溫明顯（1985-），男，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31071593）；北京市教委科技面上項(xiàng)目（KM201110011001）；北京市屬高校人才強(qiáng)教計(jì)劃項(xiàng)目（PHR201008237）。