蘭信海 馮永勝 衣服德 （山東省青島市畜牧獸醫(yī)研究所 266100）

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雞抗小鵝瘟精致高免蛋黃抗體的研制

蘭信海 馮永勝 衣服德 （山東省青島市畜牧獸醫(yī)研究所 266100）

利用發(fā)生小鵝瘟死亡的鵝的病料分離病毒，經(jīng)處理后制備抗原，以制備的小鵝瘟滅活油乳劑抗原對(duì)試驗(yàn)雞頸部皮下注射0.5ml/只；2周后加倍量進(jìn)行強(qiáng)化免疫；間隔2周后用滅活油乳劑抗原再次強(qiáng)化免疫1次，頸部皮下注射2.0ml/只；以后間隔8周進(jìn)行1次強(qiáng)化免疫，每次頸部皮下注射2.0ml/只；用瓊擴(kuò)方法檢測(cè)萃提蛋黃上清液中抗小鵝瘟特異抗體效價(jià)，直到抗體效價(jià)達(dá)到1:64以上即可集蛋，用于制備瓊擴(kuò)抗體效價(jià)達(dá)到1:32及以上小鵝瘟蛋黃抗體；并對(duì)抗體進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、安全試驗(yàn)、效力試驗(yàn)、臨床治療試驗(yàn)等，效果明顯。

小鵝瘟 高免蛋黃抗體 強(qiáng)化免疫

小鵝瘟是由鵝細(xì)小病毒引起的雛鵝急性敗血性傳染病。病雛鵝的臨診特點(diǎn)是精神委頓，食欲廢絕，嚴(yán)重下痢，有時(shí)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，死亡率高。對(duì)養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展，影響極大，搞好小鵝瘟的防治工作是當(dāng)務(wù)之急小鵝瘟高免抗體對(duì)于治療該病效果明顯。

1 材料和方法

1.1 毒種及抗原的制備 將冷凍保存的患小鵝瘟疾病死亡的小鵝腸道病料按照1:5加滅菌生理鹽水搗碎，凍融2次后，形成混合組織懸液；將混合組織懸液進(jìn)行4 000rpm離心，收集上清液并于56℃處理30min，每毫升加入青霉素和鏈霉素1 000IU，4℃處理2h；將青、鏈霉素處理后的種毒液用滅菌生理鹽水稀釋100倍，經(jīng)0.22mm微孔濾膜過濾除菌，以0.1ml/只的劑量接種13~15日齡非免疫鵝胚尿囊腔，37℃孵育，棄去48h內(nèi)的死亡鵝胚，收集48~120h內(nèi)死亡的胚；無菌采集尿囊液及羊水作為抗原；

1.2 疫苗的制備 將收獲的尿囊毒液中加入0.1%甲醛溶液，37℃密閉滅活48h；滅活完成后，按滅活毒液96份，滅菌吐溫-80，4份配制，即為制苗用抗原；按油相3份、水相1份的比例取油相、水相攪拌均勻，加入高壓均質(zhì)機(jī)中，調(diào)節(jié)壓力為35mpa，乳化制備成小鵝瘟滅活油乳劑疫苗，并加入1%硫柳汞溶液使之終濃度為0.01%；

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇 選擇健康無病，200日齡蛋雞100只供試驗(yàn)用。

1.4 抗體的制作 （1）以制備的小鵝瘟滅活油乳劑抗原對(duì)試驗(yàn)雞頸部皮下注射0.5ml/只；2周后，以制備的小鵝瘟滅活油乳劑抗原頸部皮下注射1.0ml/只，進(jìn)行強(qiáng)化免疫；間隔2周后用滅活油乳劑抗原再次強(qiáng)化免疫1次，頸部皮下注射2.0ml/只；以后間隔8周進(jìn)行1次強(qiáng)化免疫，每次頸部皮下注射2.0ml/只；（2）從第2次強(qiáng)化免疫后第７d開始，每隔3d抽樣用瓊脂擴(kuò)散方法測(cè)定高免蛋黃中抗小鵝瘟特異抗體效價(jià)；蛋黃與生理鹽水按1:3(V/V)稀釋后，加與蛋黃等體積三氯甲烷進(jìn)行萃提，用瓊擴(kuò)方法檢測(cè)萃提上清液中抗小鵝瘟特異抗體效價(jià)，若上清液瓊擴(kuò)抗體效價(jià)達(dá)到1:64以上即可集蛋，用于制備小鵝瘟蛋黃抗體；（3）將蛋殼消毒，打蛋并充分除去蛋清、胚盤和系帶，收集蛋黃；于蛋黃中加入3倍體積的生理鹽水，充分?jǐn)嚢杈鶆?，然后在蛋黃液中加入與蛋黃等體積的三氯甲烷，充分振蕩混合均勻，室溫作用60min，以3500~ 4000rpm離心30min，收集上層清液備用；（4）在分離的上清液中加入終濃度為0.05%的甲醛溶液，充分?jǐn)嚢杌靹颍?7℃保溫密封8~12h；用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，即得瓊擴(kuò)抗體效價(jià)達(dá)到1:32及以上異源抗小鵝瘟蛋黃抗體。

2 抗體的檢驗(yàn)

2.1 無菌檢驗(yàn) 將生產(chǎn)的抗體抽檢2份，各以0.1ml分別接種于普通瓊脂斜面和肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，無菌生長(zhǎng)為合格。

2.2 效價(jià)測(cè)定 以AGP法測(cè)定抗體效價(jià)，共進(jìn)行5批，效價(jià)均在1:32以上。

2.3 安全試驗(yàn) 選擇同批同日10日齡易感鴨30只，隨機(jī)分為3組，每組10只，第1組每只注射5ml，第2組每只注射10ml，第3組每只注射15ml，隔離觀察1周，以健活為安全。結(jié)果3組30只鴨的精神、采食和飲水均正常，無死亡，確定為安全。

2.4 效力試驗(yàn) 試驗(yàn)時(shí)應(yīng)用不同抗體水平，與一定組織毒相互作用，37℃恒溫箱中作用1h，而后取一定量經(jīng)口服、注射，并設(shè)抗體對(duì)照組，觀察1周，注意有無發(fā)病。

3 結(jié)果

3.1 不同抗體水平的保護(hù)率 見表1。

表1 不同抗體水平的保護(hù)率

3.2 臨床治療效果 選40只10日齡的雛鴨，分4組，每組10只，1、2、3、4組(對(duì)照組)用強(qiáng)毒攻毒，每只2ml，致病的鴨于發(fā)病第2天用不同劑量的抗體(1組為0.5ml，2組為1ml，3組為2ml，4組不注射)進(jìn)行治療，觀察治療效果。結(jié)果如表2。

表2 臨床治療試驗(yàn)效果

4 結(jié)論

由表1可以看出，抗體效價(jià)達(dá)到1:32時(shí)，試驗(yàn)保護(hù)率可達(dá)90%，并且，抗體越高保護(hù)效果越好。由表2可以看出，保護(hù)率為1組90%，2、3組為100%，4組未注射抗體無保護(hù)率。結(jié)果表明，用此方法生產(chǎn)的高免抗體安全性強(qiáng)，效果良好，是解決小鵝瘟的有效方法。

（2011–02–28）

S852.4+3

A

1007-1733(2011)04-0015-02