鄭民強，鄧煒，黃聰，張靜

（貴陽中醫(yī)學院藥理教研室，貴州 貴陽 550002）

藥理研究

兩種黔產淫羊藿總黃酮對爪鼠學習記憶的對比研究△

鄭民強，鄧煒*，黃聰，張靜

（貴陽中醫(yī)學院藥理教研室，貴州 貴陽 550002）

目的：研究貴州地方品種粗毛淫羊藿與黔嶺淫羊藿中淫羊藿總黃酮（TFE）對化學藥物誘導的癡呆小鼠模型學習記憶能力的影響，比較兩種黔產淫羊藿TFE對小鼠學習記憶改善效果差異。方法：實驗選用東莨菪堿、戊巴比妥、環(huán)磷酰胺3種化學藥品分別復制出學習記憶損傷模型，按劑量1300，650 mg·kg－1灌胃TFE 14 d，采用Morris水迷宮實驗，以定位航行實驗和空間探索能力為指標進行其行為學檢測。結果：兩種TFE均能改善東莨菪堿等3種化學藥物致癡呆小鼠學習記憶能力，且呈量效依賴關系。粗毛淫羊藿比黔嶺淫羊藿改善記憶能力效果更好一些。結論：兩種黔產淫羊藿TFE可明顯改善東莨菪堿、戊巴比妥、環(huán)磷酰胺3種化學藥物所致的空間記憶障礙，其效果與腦復康效果接近。兩種TFE作用差異明顯，粗毛淫羊藿優(yōu)于黔嶺淫羊藿。提示ICA是TFE中增強記憶的主要物質基礎；同時也提示除了ICA外，TFE中尚有其他改善學習記憶的有效成分。

黔嶺淫羊藿；粗毛淫羊藿；淫羊藿總黃酮，學習記憶；比較研究

黔產粗毛淫羊藿Epimedium acuminatumFranch、黔嶺淫羊藿E.leptorrhizumStearn為《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》收載品種，為淫羊藿常用中藥及民族藥品種。據(jù)調查，目前以淫羊藿為主要生產原料的貴州多家藥廠及飲片配方仍以粗毛淫羊藿、黔嶺淫羊藿等為主要來源。淫羊藿總黃酮（TFE）是淫羊藿主要藥效成分，而淫羊藿苷（ICA）則是淫羊藿總黃酮中的主要藥效物質基礎。據(jù)研究報道貴州產多種淫羊藿其TFE、ICA含量均能達到或超過《中國藥典》1995年版標準，但黔嶺淫羊藿地上部分中ICA含量卻很低，小于0.1%［1］，其藥理作用與同屬植物其他藥用種是否存在差異，國內外未見報道。學習記憶能力減退是衰老和老年癡呆的共同臨床表現(xiàn)，多種化學藥品可致記憶缺失，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)TFE、ICA有益智，增強記憶作用［2，3］。本研究分別提取粗毛淫羊藿、黔嶺淫羊藿總黃酮物質，對東莨菪堿、戊巴比妥、環(huán)磷酰胺致學習記憶損傷模型小鼠進行實驗研究，比較兩種藥物對不同學習記憶障礙模型的改善作用之差異，以評價其藥用價值。

1 材料

1.1 實驗動物

昆明種健康小鼠，清潔級，體重（22±2）g，雌雄兼用，由貴陽醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（黔）2002-001。在實驗條件下適應3 d后，進行試驗。

1.2 藥品

藥材樣品分別采自貴州貴陽市烏當區(qū)，貴州惠水縣，經過貴陽中醫(yī)學院何順志教授準確鑒定為粗毛淫羊藿Epimedium acuminatumFranch、黔嶺淫羊藿E.leptorrhizumStearn。兩種淫羊藿TFE提取：各取干燥淫羊藿莖葉1kg，照文獻方法提取［4］，分別得總黃酮提取物32.28，27.44 g，得率為3.23%，2.74%；經紫外分光光度法測定其TFE含量以ICA計分別為58.4%，31.4%。分別用生理鹽水制備成130，65 mg·mL－12個濃度為實驗用藥。

氫溴酸東莨菪堿（Scopolamine，Sco）注射液（廣州明興制藥廠，批號：20070202）；環(huán)磷酰胺注射劑（Cyclophosphammide，Cy）（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：20081205）；戊巴比妥鈉（pentobarbital，ptb）（分析純）［中國醫(yī)藥（集團）上海化學試劑公司，批號：F20021216］；腦復康片（piracetam tablet，廣州華南制藥廠，批號：20080403）。

1.3 儀器

Morris水迷宮系統(tǒng)（中國醫(yī)學科學院藥物研究所）；DT-200電子天平（美國雙杰集團常熟雙杰測試儀器廠）。

2 方法

2.1 實驗動物訓練、篩選及實驗

實驗前須先對小鼠進行 Morris水迷宮訓練。Morris水迷宮為一不銹鋼圓柱形水池（120cm×50cm）和一可移動位置的圓柱形平臺（10cm×24cm）組成。實驗水深25cm（沒過平臺1cm），水溫（23±2）℃，水中加入白乳化劑以遮隱平臺。水池正上方攝像頭與計算機連接，實驗時對動物活動全程跟蹤，可記錄動物游泳軌跡、定位航行、逃避潛伏期、空間探索能力、航行距離以及游泳速度等指標。

本實驗設定定位航行實驗和空間探索能力2項指標為小鼠學習記憶能力判定指標。定位航行實驗訓練：將水池分成4個象限，在第一象限正中放置平臺。分別將小鼠從第三象限面壁逐一放入水中，觀察記錄小鼠2min內尋找并爬上平臺的時間為逃避潛伏期。2min內找到平臺為合格動物，讓動物于平臺上停留10 s后取出。如果在2min內未找到平臺，將其引至平臺上，并停留10 s取出，再進行下一只?？臻g探索能力訓練：移去平臺，將小鼠從對側象限面壁放入池中，記錄小鼠2min內穿越平臺位置的次數(shù)。將訓練小鼠無明顯智能差異者為合格留用，不合格者淘汰。正式實驗時定位航行實驗測試2次·d－1×3 d；空間探索能力測試 2次·d－1×2 d。

2.2 實驗分組及給藥

正式實驗時每個實驗分別取訓練合格小鼠70只，隨機分7組，為空白對照組，化學藥物致記憶損傷模型組，腦復康陽性對照組500 mg·kg－1，粗毛TFE高、低（1300，650 mg·kg－1）劑量組，黔嶺TFE高、低（1300，650 mg·kg－1）劑量組。除空白對照組及模型組給予等容積0.9%氯化鈉溶液，各組均按劑量灌胃給藥14 d。

2.2.1 兩種TFE對小鼠東莨菪堿（Sco）所致的獲得性記憶障礙的改善作用 于給藥第9天起每天對各組小鼠（空白組除外）給予 Sco 2 mg·kg－1，ip，25min后，進行小鼠水迷宮實驗，檢測定位航行和空間探索能力，觀察并記錄數(shù)據(jù)。

2.2.2 兩種TFE對小鼠戊巴比妥（ptb）所致的方向辨別障礙的保護作用 于給藥第9天起每天對各組小鼠（空白組除外）給予 ptb 15 mg·kg－1，ip，25min后，進行小鼠水迷宮實驗，檢測定位航行和空間探索能力，觀察并記錄數(shù)據(jù)。

2.2.3 兩種TFE對環(huán)磷酰胺（Cy）誘導小鼠學習和記憶障礙的影響 于給藥第9天對各組小鼠（空白組除外）給予 Cy 80 mg·kg－1，ip，造成學習記憶障礙的動物模型，1 h后，采用水迷宮法檢測小鼠定位航行和空間探索能力，連續(xù)5 d，觀察并記錄數(shù)據(jù)。

2.3 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 兩種TFE對Sco小鼠獲得性記憶障礙的改善作用

結果見表1。

表1 兩種TFE對Sco小鼠學習記憶的影響（±s）

表1 兩種TFE對Sco小鼠學習記憶的影響（±s）

注：（1）n＝10；（2）與對照組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量／mg·kg逃避潛伏期／s 跨越平臺次數(shù)／次－1第1天 第2天 第3天 第4天 第5天.95 8.83±2.25 Sco模型組 2 91.62±22.74▲▲ 93.61±28.47▲▲ 96.72±27.12▲▲ 4.49±1.34▲▲ 3.67±0.89▲▲腦復康＋Sco 500＋2 68.38±10.51** 63.55±18.96** 65.42±22.53** 6.68±2.06** 5.00±2.00*粗毛TFE高＋Sco 1300＋2 53.59±21.98** 57.60±25.37** 68.42±22.11** 6.26±1.64** 5.25±2.22**粗毛TFE低＋Sco 650＋2 67.16±23.29** 66.97±22.39** 76.86±16.26* 5.60±1.57* 5.75±2.41**黔嶺TFE高＋Sco 1300＋2 69.05±19.89** 78.57±25.47* 66.17±15.35** 6.70±1.27** 5.30±1.81**黔嶺TFE低＋Sco 650＋2 74.12±11.84* 78.38±1.92* 74.03±29.25* 5.39±1.73* 5.80±1.66空白對照組 42.15±19.90 43.84±24.44 53.32±19.30 9.94±2**

表1顯示，與正常對照組比較，模型組逃避潛伏期明顯增加，跨越平臺次數(shù)顯著減少（P＜0.01），說明東莨菪堿可造成小鼠空間記憶障礙。與模型組比較，兩種TFE高、低劑量組小鼠水迷宮游泳逃避潛伏期均顯著減少，跨越平臺次數(shù)顯著增加，與腦復康組沒有顯著差別；兩種TFE高劑量組療效較好，說明有量效依賴性；粗毛淫羊藿顯示出更為明顯的效應。提示2種黔產TFE均可對抗2 mg·kg－1東莨菪堿所造成的小鼠學習記憶獲得障礙，能提高定位航行和空間探索能力，對東莨菪堿所致小鼠記憶獲得障礙具有明顯的改善作用。

3.2 兩種TFE對ptb小鼠方向辨別障礙的保護作用

結果見表2。

表2 兩種TFE對ptb小鼠方向辨別障礙的保護作用±s）

表2 兩種TFE對ptb小鼠方向辨別障礙的保護作用±s）

注：（1）n＝10；（2）與對照組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量／mg·kg逃避潛伏期／s 跨越平臺次數(shù)／次－1第1天 第2天 第3天 第4天 第5天13 7.12±1.10 ptb模型組 15 102.24±21.13▲▲ 97.24±21.46▲▲ 96.23±18.14▲▲ 3.14±1.19▲▲ 3.18±1.13▲▲腦復康＋ptb 500＋15 61.46±21.27**66.84±15.43** 68.90±11.49** 5.19±1.13** 5.18±1.16**粗毛TFE高＋ptb 1300＋15 59.38±21.18**61.27±14.27** 66.87±17.13** 5.17±1.53** 5.24±1.71**粗毛TFE低＋ptb 650＋15 69.51±31.05**75.23±21.51* 78.19±12.19* 4.81±1.14** 5.13±1.62**黔嶺TFE高＋ptb 1300＋15 64.31±24.22**77.42±29.68* 65.33±10.21** 4.73±2.44* 5.01±2.87*黔嶺TFE低＋ptb 650＋15 73.24±15.07**76.54±27.30* 76.52±20.03* 4.24±1.76* 4.17±1.53空白對照組 46.89±31.0 51.81±17.22 55.16±11.70 8.17±1.*

巴比妥對中樞神經系統(tǒng)具有顯著的抑制作用，可導致方向辨別障礙。表2結果顯示，與空白對照組比較，ptb模型組逃避潛伏期明顯增加，跨越平臺次數(shù)顯著減少（P＜0.01），提示小鼠記憶障礙模型形成。連續(xù)給藥14 d后，與模型組比較兩種TFE高、低劑量組小鼠游泳逃避潛伏期均顯著減少，跨越平臺次數(shù)顯著增加，與陽性藥組差異不明顯；兩種TFE高劑量組療效較好，呈明顯量效依賴。表明TFE可明顯提高ptb小鼠正確辨別方向的能力，對ptb小鼠所致的方向辨別障礙有一定的改善和保護作用。本實驗粗毛淫羊藿療效優(yōu)于黔嶺淫羊藿。

3.3 兩種TFE對Cy小鼠學習記憶障礙的影響

結果見表3。

本實驗結果與文獻［5］報道一致，Cy可使小鼠學習記憶缺失，與正常對照組比較，Cy模型組逃避潛伏期明顯增加，跨越平臺次數(shù)顯著減少（P＜0.01），提示小鼠記憶障礙形成。TFE的促智作用已有報道［2］，但探討TFE對Cy誘導小鼠學習記憶缺失的影響未見報道。表3研究結果表明，與Cy組比較，TFE可使Cy小鼠逃避潛伏期明顯縮短，跨越平臺次數(shù)顯著增加，尤以粗毛淫羊藿作用顯著（P＜0.01），與腦復康組沒有明顯差別，提示兩種TFE都能提高Cy小鼠定位航行和空間探索能力，對Cy小鼠學習記憶障礙有明顯的改善作用，以粗毛淫羊藿效果為好。

表3 兩種TFE對Cy小鼠學習記憶的影響（±s）

表3 兩種TFE對Cy小鼠學習記憶的影響（±s）

注：（1）n＝10；（2）與對照組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量／mg·kg逃避潛伏期／s 跨越平臺次數(shù)／次－1第1天 第2天 第3天 第4天 第5天.08 8.16±1.11 Cy模型組 80 102.47±29.35▲▲ 93.63±16.63▲▲ 103.11±26.02▲▲ 4.26±2.07▲▲ 4.73±1.24▲▲腦復康＋Cy 500＋80 70.35±17.11**61.42±14.28** 78.91±27.03**7.29±2.53** 6.71±1.36**粗毛TFE高＋Cy 1300＋80 68.14±40.44**56.64±23.37** 76.33±24.17**6.58±1.76** 6.25±1.52**粗毛TFE低＋Cy 650＋80 74.13±43.21* 69.37±18.09** 68.33±22.16**5.51±1.42* 5.79±1.10*黔嶺TFE高＋Cy 1300＋80 64.25±44.06**59.43±17.12** 67.11±20.29**7.36±2.75** 5.74±1.27*黔嶺TFE低＋Cy 650＋80 83.52±15.78* 75.87±15.14* 72.35±13.43**空白對照組 64.16±10.18 42.70±18.45 59.78±27.93 8.44±24.99±3.08 4.78±1.61

4 討論

改善學習、增強記憶功能是評價藥物抗癡呆有效性的重要指標［6］，據(jù)研究，改善動物學習和記憶能力的藥物對治療人類癡呆癥同樣有效?，F(xiàn)代藥理研究表明，淫羊藿在骨質代謝、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、中樞神經系統(tǒng)等具有多方面的顯著生物學活性，TFE是這些功能的有效成分，而ICA則是TFE中主要藥效物質基礎［7］。黔嶺淫羊藿地上部分因ICA含量極少，不主張作為藥用品［1］，但缺乏相關的藥效依據(jù)支撐。本研究以小鼠空間記憶能力為指標，比較研究兩種黔產淫羊藿TFE對改善小鼠認知功能的作用，結果證明兩者均有較好的作用。

人的記憶思維與中樞膽堿能神經功能密切相關，海馬及其環(huán)路功能遭受破壞，會發(fā)生近期記憶障礙［6］。東莨菪堿作為中樞膽堿能受體拮抗劑，可降低大腦皮質和海馬膽堿能系統(tǒng)活性，對記憶獲得產生阻抑效應。本實驗采用測試前給藥觀察到兩種TFE可對抗東莨菪堿引起的記憶獲得障礙，提示可能與膽堿能神經功能改善有關。但目前的研究還缺乏證據(jù)證明TFE如何改善膽堿能神經，是否提高乙酰膽堿的含量和膽堿受體功能。巴比妥通過影響中樞GABA能神經功能，產生中樞抑制作用，可導致方向辨別障礙。研究揭示［7］齒狀回GABA能神經減少越明顯，老年學習記憶損害越嚴重。本研究結果表明TFE對戊巴比妥鈉引起的小鼠方向辨別障礙有一定的保護作用，與模型組比較具有明顯的差異，以高劑量組作用較強；粗毛淫羊藿顯示出更為明顯的差異。這是否是通過增加齒狀回GABA能神經來改善記憶障礙，有待深入研究。環(huán)磷酰胺通過與DNA交叉聯(lián)結，干擾RNA轉錄而抑制蛋白質合成，環(huán)磷酰胺能導致記憶缺失，可能與腦內新蛋白質的合成減少密切相關［8］。兩種TFE對環(huán)磷酰胺所造成的記憶鞏固缺陷有改善作用，是否與TFE促進蛋白質合成作用有關，有待進一步研究。

兩種淫羊藿總黃酮均可對抗東莨菪堿、戊巴比妥、環(huán)磷酰胺3種化學藥物所致的記憶障礙，明顯改善記憶功能，且呈量效依賴性，提示本品具有易化記憶、提高智力和減緩智力衰退作用。從3個實驗結果看，粗毛淫羊藿TFE改善記憶作用明顯優(yōu)于黔嶺淫羊藿TFE，提示ICA可能是TFE中主要增強記憶的物質基礎；同時也提示TFE中除了ICA外，尚有其他改善學習記憶的有效成分。

［1］何順治，郭寶林.貴州產淫羊藿的質量研究［J］.藥物分析雜志，1996，16（5）：291.

［2］蔣淑君，楊麗娟，許勇，等.淫羊藿總黃酮對癡呆模型大鼠學習記憶功能及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2008，18（23）：26.

［3］張翔南，王歡歡，王志強，等.淫羊藿素抗Aβ肽致大鼠原代培養(yǎng)神經細胞凋亡作用［J］.浙江大學學報（醫(yī)學版），2007，36（3）：223.

［4］宋劍，王超，李知遙，等.淫羊蕾總黃酮抗老年癡呆化學成分研究［J］.中國現(xiàn)代中藥，2009，11（8）：23.

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［7］柯尊記.老年學習記憶減退的神經行為學基礎［J］.生理科學進展，1997，28（4）：328.

［8］溫富春，許家潔，王玉紅，等.安神補腦液對小鼠學習記憶能力及腦內蛋白質合成的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14（8）：23.

Comparative Study on TFE of Two Species of Epimedium in Guizhou on the Learning Memory Disorder

ZHENG min-qiang，DENG Wei，HUANG Cong，ZHANG Jing
（Dept.of Pharmacology Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China）

Objective：Study on the effect of TFE in Epimedium acuminatum and E.leptorrhizum in Guizhou to learning-memory impairment model mice induced by scopolamine chemical substances etc.Methods：To set up memory disorder mice by scopolamine，pentobarbital and cyclophosphamide were injecting intraperitoneal and by TFE of two species of 1300，650 mg·kg－1×14 d from the mice ig.The Morris Water Maze was used to check directional navigation experiments and space exploration experiments.Results：The two species of TFE have an obvious improved for three different memory disorder mice induced by scopolamine etc.and both of the 2 species of TFE showed concentration-response dependence.Among them，The effect of improve the learning and memorizing ability inmice，the TFE of E.acuminatum is better.Conclusion：Both the TFE the 2 species of Epimedium in Guizhou could obviously improved of space learingmemory disorder by scopolamine，pentobarbital and cyclophosphamide.Their effect is similar with the Piracetam Tablets.E.acuminatum superior to E.leptorrhizum and there is great difference between them.The results suggest that the ICA is the main substance improve memory.Also hints，may be there′s another bioactive components of improvememory except the ICA in TFE.

Epimedium leptorrhizum；E.acuminatum；TFE；Learning and memory；Comparative study

貴陽中醫(yī)學院科研項目（2008-01-15）

*鄧煒，E-mail：dengwei0517＠yahoo.cn

2010-08-27）