王金輝，黃健， 鞏平， 李國(guó)玉， 魏秀巖， 秦穎， 張翠， 楊琳， 王瑩

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002;2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，沈陽(yáng)遼寧 110016;3.教育部省部共建新疆特種植物藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002)

藥理研究

阿魏側(cè)耳多糖抗癌作用機(jī)理研究△

王金輝1，2，3，*，黃健2*， 鞏平1， 李國(guó)玉1， 魏秀巖2， 秦穎2， 張翠2， 楊琳1， 王瑩1

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002;2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，沈陽(yáng)遼寧 110016;3.教育部省部共建新疆特種植物藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002)

目的:阿魏側(cè)耳 (阿魏菇)多糖(Pleurotus ferulae polysaccharide，PFP)抗宮頸癌作用的機(jī)理研究。方法:MTT法、中性紅比色法和Griess法。結(jié)果:灌胃給藥500 mg·kg-1的阿魏菇多糖可抑制小鼠宮頸癌U14移植瘤的生長(zhǎng)，抑瘤率達(dá)到39%，臨床抗宮頸癌藥順鉑的抑瘤率為46.5%，阿魏菇多糖與順鉑共同作用時(shí)，抑瘤率達(dá)到65.1%;但是在體外實(shí)驗(yàn)中，不同濃度阿魏菇多糖分別作用于人宮頸癌HeLa和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞不同時(shí)間后，卻不能抑制兩種細(xì)胞的生長(zhǎng);在5μg·mL-1的脂多糖刺激下，阿魏菇多糖不能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖;不同濃度的阿魏菇多糖作用于腹腔巨噬細(xì)胞24 h，能使腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力顯著增強(qiáng)，并且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，與此同時(shí)阿魏菇多糖也促進(jìn)了腹腔巨噬細(xì)胞的增殖，但是卻不能刺激腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO。結(jié)論阿魏菇的抗宮頸癌機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)小鼠機(jī)體免疫功能而實(shí)現(xiàn)的。

阿魏菇多糖;U14荷瘤小鼠;腹腔巨噬細(xì)胞;脾淋巴細(xì)胞

阿魏側(cè)耳Pleurotus ferulaeLanzi，又名阿魏菇，阿魏蘑，因其生長(zhǎng)在新疆干旱草原上的草本植物阿魏上而得名。其子實(shí)體菌肉肥厚、味道鮮美、口感柔潤(rùn)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1]。阿魏側(cè)耳中含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如含有多種維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和微量元素，其中蛋白質(zhì)的含量可高達(dá)子實(shí)體干重的20%[2，3]。除此之外，阿魏側(cè)耳中所含的多糖據(jù)報(bào)道是其中的生物活性成分，具有抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化和抗衰老等功效[4]。本文對(duì)阿魏側(cè)耳多糖的抗宮頸癌的活性進(jìn)行了測(cè)試，并對(duì)其抗癌的作用機(jī)理進(jìn)行了初步的研究。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康昆明系小鼠，6～8周齡，雄性，體重18～22 g，購(gòu)自新疆大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物隨機(jī)分組后置于溫度20～24℃，恒濕(55±5)%，12 h光照(8∶00 ～20∶00)、 12 h 黑暗、 隔音的動(dòng)物室內(nèi)，自由攝食、飲水。

1.2 瘤細(xì)胞株

小鼠宮頸癌U14細(xì)胞株，小鼠腹腔傳代，購(gòu)自北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)時(shí)，當(dāng)傳代的小鼠腹水變白時(shí)，采集腹水并用0.9%的氯化鈉溶液稀釋成1×107·mL-1的瘤細(xì)胞懸液備用。

1.3 主要試劑及儀器

順鉑(Diaminodichloroplatin，DDP，齊魯制藥有限公司，批號(hào):9120532DC);RPMI 1640培養(yǎng)液，脂多糖(LPS)，小鼠淋巴細(xì)胞分層液，DMSO，四甲基偶氮唑鹽(MTT)，滅活小牛血清，PBS緩沖液，均為Sigma公司產(chǎn)品;DMEM培養(yǎng)液(GIBCO公司);MTT以pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)配成5 mg·mL-1備用。Griess試劑以蒸餾水配制0.1%鹽酸萘乙二胺(Sigma產(chǎn)品)，5%磷酸配制1%磺胺嘧啶(Sigma產(chǎn)品)，臨用前兩者等量混合。美國(guó)BIORAD伯樂(lè)酶標(biāo)儀(680)由沈陽(yáng)藥科大學(xué)提供。

1.4 試藥

阿魏菇購(gòu)于新疆石河子市，經(jīng)石河子大學(xué)譚勇博士鑒定為阿魏側(cè)耳PleurotusferulaeLanzi，標(biāo)本號(hào)為No.20071002001，保存在石河子大學(xué)藥學(xué)院。

阿魏菇加水熱提取1次，浸提溫度70℃，浸提2 h，料液比1∶40。阿魏菇水提取物加入木瓜蛋白酶(酶底比8 mg·g-1)，用HCl分別調(diào)pH為6，60℃水浴90 min水解后，沸水浴10 min使酶滅活，冷卻至室溫，3 000 r·min-1離心5 min，取上清液加95%乙醇至醇濃度80%，3 000 r·min-1離心10 min取沉淀，得阿魏菇多糖，得率3.1%。

2 方法

2.1 阿魏側(cè)耳多糖對(duì)U14荷瘤小鼠的抑瘤率

小鼠32只均于右腋下接種107·mL-1濃度的U14小鼠宮頸癌細(xì)胞懸液0.2 mL，隨機(jī)分為4組，每組8只，待瘤長(zhǎng)至米粒大小后開(kāi)始分組給藥，模型組隔天腹腔注射無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液(NS)0.2 mL/只，順鉑組隔天腹腔注射3 mg·kg-1的順鉑0.2 mL/只，阿魏側(cè)耳組每天用500 mg·kg-1阿魏側(cè)耳多糖0.2 mL/只灌胃，阿魏側(cè)耳+順鉑組每天用500 mg·kg-1的阿魏側(cè)耳多糖0.2 mL/只灌胃，隔天腹腔注射3 mg·kg-1的順鉑0.2 mL/只，連續(xù)10 d。所有小鼠初始體重，于第11天處死小鼠，稱重，剝?nèi)×鰤K，洗去血漬，用吸水紙吸干水分，稱重。

抑瘤率(%)=對(duì)照組(NS)平均瘤重-給藥組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重×100%

2.2 人宮頸癌HeLa和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

人宮頸癌HeLa和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，用培養(yǎng)液RPMI 1640混懸細(xì)胞至濃度4×105個(gè)·mL-1，分別接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL。培養(yǎng)12 h，分別加入不同濃度的阿魏側(cè)耳多糖，培養(yǎng)24 h后，MTT法測(cè)定兩種細(xì)胞生長(zhǎng)率，酶標(biāo)儀570 nm測(cè)A值。

細(xì)胞生 長(zhǎng) 率 (%) = [A570(給藥)-A570(空白)]/[A570(陰性)-A570(空白)] ×100

2.3 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

無(wú)菌取小鼠脾臟，按常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，最后用DMEM培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度至1×106·mL-1。取上述細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔100μL，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及LPS對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組及陰性對(duì)照組加DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，除空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組外，各組分別加入LPS至終濃度為5μg·mL-1，其他給藥組分別加入阿魏側(cè)耳多糖至終濃度為 3， 6， 12， 25， 50， 100 μg·mL-1。用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖率，酶標(biāo)儀570 nm測(cè)A值。

細(xì)胞增殖率(%) = [A570(LPS或給藥)-A570(空白)]/[A570(陰性)-A570(空白)] ×100

2.4 腹腔Mφ吞噬功能測(cè)定(中性紅比色法)

用冷PBS注入小鼠腹腔，常規(guī)制備腹腔Mφ懸液。用完全DMEM培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度至1×106·mL-1，加入96孔板，每孔100μL，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后，棄未黏附細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組。空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組加DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，其他給藥組分別加入阿魏側(cè)耳多糖至終濃度為3， 6， 12， 25， 50， 100 μg·mL-1， 置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，棄上清液，加入0.072%的中性紅溶液100μL/孔，培養(yǎng)30 min后，以PBS洗2次，加入腹腔Mφ裂解液200μL/孔，4℃靜置過(guò)夜，酶標(biāo)儀530 nm測(cè)A值。

2.5 腹腔MφNO釋放能力測(cè)定(Griess法)

腹腔Mφ制備、加樣、分組同上。經(jīng)37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h，取上清液100μL加至另一塊96孔板相應(yīng)位置，加入Griess液100μL/孔，25℃反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀530 nm測(cè)A值。

分析兩組行口腔修復(fù)患者的臨床治療效果、口腔舒適度、患者滿意度、口腔修復(fù)體匹配程度、生活質(zhì)量。行口腔修復(fù)患者臨床總有效率的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。顯效:口腔修復(fù)體與牙齦接觸良好。有效:口腔修復(fù)體與牙齦邊緣接觸一般。無(wú)效:口腔修復(fù)體與牙齦邊緣接觸較差。治療總有效率=顯效率+有效率?；颊邼M意度采用本院自制量表進(jìn)行評(píng)價(jià),總分100分,非常滿意:總評(píng)分≥85分;一般:總評(píng)分70-85分;不滿意:總評(píng)分<70分?；颊邼M意度=非常滿意+一般。生活質(zhì)量采用SF-36量表進(jìn)行評(píng)價(jià),患者得分越高,生活質(zhì)量越高[3]。

2.6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

用冷PBS注入小鼠腹腔，常規(guī)制備腹腔Mφ懸液，用DMEM培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度至1×106·mL-1。其余操作同2.3。

2.7 統(tǒng)計(jì)方法

各組數(shù)據(jù)采用組間方差分析和t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理。

3 結(jié)果

3.1 阿魏側(cè)耳多糖對(duì)宮頸癌U14荷瘤鼠生長(zhǎng)的影響

圖1結(jié)果顯示，500 mg·kg-1的阿魏側(cè)耳多糖抑瘤率達(dá)到39%，表明其具有很強(qiáng)的抑制小鼠宮頸癌U14移植瘤生長(zhǎng)的作用;臨床抗宮頸癌藥順鉑的抑瘤率為46.5%;阿魏側(cè)耳多糖與臨床抗宮頸癌藥順鉑共同作用時(shí)，抑瘤率達(dá)到65.1%，說(shuō)明阿魏側(cè)耳多糖可以提高順鉑的抗癌療效。

圖1 阿魏側(cè)耳多糖對(duì)U14荷瘤鼠生長(zhǎng)影響圖

3.2 阿魏側(cè)耳多糖對(duì)人宮頸癌HeLa和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

不同濃度阿魏側(cè)耳多糖3，6，12，25，50，100 μg·mL-1分別作用于人宮頸癌 HeLa和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞12，24，36 h后的結(jié)果如圖2，3所示，對(duì)兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)情況幾乎沒(méi)產(chǎn)生影響(無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分布均勻，自然舒展且細(xì)胞壁完整(如圖4，5所示)。以上實(shí)驗(yàn)表明阿魏側(cè)耳多糖在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有直接抑制作用。

圖2 MTT法測(cè)定阿魏側(cè)耳多糖對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)影響圖(n=3,s)

圖3 MTT法測(cè)定阿魏側(cè)耳多糖對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)影響圖(n=3,xs)

圖4 阿魏側(cè)耳多糖處理人宮頸癌HeLa細(xì)胞24 h的細(xì)胞形態(tài)圖

圖5 阿魏側(cè)耳多糖處理人乳腺癌MCF-7細(xì)胞24 h的細(xì)胞形態(tài)圖

3.3 阿魏側(cè)耳多糖對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響

5μg·mL-1的LPS單獨(dú)作用脾淋巴細(xì)胞24 h，促進(jìn)了脾淋巴細(xì)胞的增殖，與DMEM培養(yǎng)的陰性對(duì)照組(100%)相比，細(xì)胞的增殖率為135%。但是不同濃度的阿魏側(cè)耳多糖和LPS共同作用組與LPS單獨(dú)作用組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明阿魏側(cè)耳多糖對(duì)LPS沒(méi)有協(xié)同增殖作用，如圖6所示。

圖6 MTT法測(cè)定阿魏側(cè)耳多糖對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖影響圖(n=3,x±s)

3.4 阿魏側(cè)耳多糖對(duì)腹腔Mφ吞噬功能及NO釋放的影響

阿魏側(cè)耳多糖 3， 6， 12， 25， 50， 100 μg·mL-1作用于腹腔Mφ24 h，能使腹腔Mφ的吞噬能力顯著增強(qiáng)并且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，如圖7所示。但是不同濃度的阿魏側(cè)耳多糖作用于腹腔巨噬細(xì)胞，與陰性對(duì)照組(阿魏側(cè)耳多糖0μg·mL-1)相比，阿魏側(cè)耳多糖不能刺激腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO(無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，如圖8所示。

圖7 阿魏側(cè)耳多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬的影響圖(n=3,x±s)

3.5 阿魏側(cè)耳多糖對(duì)腹腔Mφ增殖的影響

3， 6， 12， 25， 50， 100 μg·mL-1的阿魏側(cè)耳多糖作用于腹腔Mφ24 h，能促進(jìn)腹腔Mφ的增殖。其中25μg·mL-1阿魏側(cè)耳多糖作用于腹腔Mφ與陰性對(duì)照組(0μg·mL-1)相比，能顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖，如圖9所示。

圖8 阿魏側(cè)耳多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞釋放NO的影響圖(n=3,xs)

圖9 M TT法測(cè)定阿魏側(cè)耳多糖對(duì)腹腔Mφ細(xì)胞的增殖影響(n=3,x±s)

4 討論

作為一種珍稀的藥食兩用資源，阿魏側(cè)耳的抗腫瘤方面的研究已有一些報(bào)道[5]。本實(shí)驗(yàn)選用了文獻(xiàn)中阿魏側(cè)耳多糖的最適劑量500 mg·kg-1，結(jié)果表明，阿魏側(cè)耳多糖對(duì)小鼠宮頸癌U14移植瘤有一定的抑制效果，抑瘤率達(dá)到39%，臨床常用的宮頸癌化療一線藥順鉑對(duì)其的抑瘤率為46.5%，阿魏側(cè)耳多糖與順鉑共同作用時(shí)，抑瘤率達(dá)到65.1%，說(shuō)明阿魏側(cè)耳多糖可以提高順鉑的抗癌療效。但是，不同濃度阿魏側(cè)耳多糖分別作用于人宮頸癌HeLa和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞不同時(shí)間后，對(duì)兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)情況幾乎沒(méi)產(chǎn)生影響，表明阿魏側(cè)耳多糖在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有直接抑制作用。

阿魏側(cè)耳的抗癌機(jī)制可能是通過(guò)其免疫激活作用實(shí)現(xiàn)的。它可激活機(jī)體免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答而發(fā)揮抗腫瘤作用，尤其是細(xì)胞免疫的激活及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子具有重要的作用。巨噬細(xì)胞是參與殺傷腫瘤的一種十分活躍的免疫效應(yīng)細(xì)胞，Mφ主要通過(guò)內(nèi)吞和分泌一些效應(yīng)分子NO等殺傷腫瘤細(xì)胞[6]。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿魏側(cè)耳多糖3，6， 12， 25， 50， 100 μg·mL-1作用于腹腔Mφ24 h，能使腹腔Mφ的吞噬能力顯著增強(qiáng)，并且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。但是3，6，12，25，50，100μg·mL-1阿魏側(cè)耳多糖作用于腹腔巨噬細(xì)胞，與陰性對(duì)照組(阿魏側(cè)耳多糖0μg·mL-1)相比，阿魏側(cè)耳多糖不能刺激腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO。同時(shí)我們也考察了相同濃度的阿魏側(cè)耳多糖對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞增殖能力的影響，阿魏側(cè)耳多糖作用于腹腔Mφ24 h，能促進(jìn)腹腔Mφ的增殖，其中25μg·mL-1阿魏側(cè)耳多糖作用于腹腔Mφ與陰性對(duì)照組(0μg·m L-1)相比，能顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

淋巴細(xì)胞包括B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，并且兩種細(xì)胞在脾臟中大量分布。T細(xì)胞在機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)中均有重要作用，其作為免疫效應(yīng)細(xì)胞，主要有兩方面功能:介導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)和直接殺傷靶細(xì)胞。B細(xì)胞通過(guò)分泌的抗體行使其免疫功能，另外活化的B細(xì)胞還具有加工和提呈抗原給T細(xì)胞的作用[7]。淋巴細(xì)胞增殖和分化是機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程的一個(gè)重要階段。因此，檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖水平是細(xì)胞免疫研究和臨床免疫功能檢測(cè)的一種常用方法。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5μg·mL-1的LPS單獨(dú)作用脾淋巴細(xì)胞，促進(jìn)了脾淋巴細(xì)胞的增殖，但是阿魏側(cè)耳多糖在LPS的刺激下，沒(méi)能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在體內(nèi)阿魏側(cè)耳多糖抑制了小鼠宮頸癌U14荷瘤增殖，然而在體外阿魏側(cè)耳多糖卻不能抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是阿魏側(cè)耳多糖促進(jìn)了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖和吞噬功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿魏側(cè)耳的抗癌機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)小鼠機(jī)體免疫功能而實(shí)現(xiàn)的。

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Study on the Mechanism s of Anti-tumor Effect of Pleurotus Ferulae Polysaccharide

WANG Jin-hui1，2，3，HUANG Jian2，GONG Ping1，LI Guo-yu1，WEI Xiu-yan2，QIN Ying2，ZHANG Cui2，YANG Lin1，WANG Ying1
(1.School of Pharmacy，Shihezi University，Shihezi832002，China;2.bSchool of Traditional Chinese Materia Medica，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang110016，China;3.KeyLaboratory of Phytomedicine Resources&Modernization of TCM，Shihezi832002，China)

Objective:To investigate the mechanisms of anti-tumor effect ofPleurotusferulaepolysaccharide(PFP)on cervix.Methods:MTT assay， neutral red colorimetry and Griess assay were used.Results:500mg·kg-1PFP(i.g.)can restrain growth of transplantation tumor U14 of cancer of the cervix(CACX)in Kunming mice and the inhibition rate was 39%.In combination PFPwith Diaminodichloroplatin，the inhibition rate against CACX U14 was 65.1%，compared with the inhibition rate of 46.5%in Diaminodichloroplatin-treated alone group.However， after treated HeLa and MCF-7 with different concentrations of PFP for different time periods， respectively，the PFP can not inhibit cell growth of the two kinds，in vitro.In the presence of 5μg·mL-1LPS， the PFP can not induce proliferation of splenic lymphocyte.Wherever，when the peritoneal macrophages were cultured with different concentrations of PFP for 24 h，the PFP was found to significantly increase the phagocytosis in a concentration dependent manner and trigger the proliferation of peritoneal macrophages， however， NO could not be detected in the same peritoneal macrophages.Conclusion:The PFP inhibited the CACX growth bymeans of improving the immune system in Kunmingmice.

Pleurotusferulaepolysaccharide(PFP);U14 tumor-bearing mice;Peritoneal macrophages;Splenic lymphocytes

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA10323)

*王金輝，Tel:(0993)2055001，E-mail:wangjh1972@vip.sina.cn;*黃健，Tel:(024)23986482，E-mail:huang-jian1977@yahoo.com.cn

2010-09-06)