時(shí)冬梅，陳復(fù)生，趙俊廷，楊宏順

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450052)

反膠束體系中酶增溶作用的研究進(jìn)展

時(shí)冬梅，陳復(fù)生*，趙俊廷，楊宏順

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450052)

論述了含酶反膠束體系的制備方法及影響因素、酶增溶于反膠束的結(jié)構(gòu)模型;對(duì)酶增溶于反膠束的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀進(jìn)行了詳細(xì)的綜述，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

反膠束，酶增溶，表面活性劑

反膠束萃取技術(shù)分離大豆蛋白和油脂與傳統(tǒng)分離技術(shù)相比具有明顯優(yōu)勢(shì):反膠束萃取過程可實(shí)現(xiàn)油脂和蛋白質(zhì)的同時(shí)分離，大大簡(jiǎn)化了蛋白和油脂分離工藝，減少固定資產(chǎn)投資，降低產(chǎn)品成本;分離過程不需要加入酸或堿，所用表面活性劑和溶劑循環(huán)使用，無廢水排放，因此解決了環(huán)境污染難題，同時(shí)無蛋白流失，產(chǎn)品得率高;萃取過程中，蛋白被反膠束內(nèi)水環(huán)境包圍，環(huán)境接近細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境，蛋白不易變性，因而保持其生物活性且純度高;另外，利用酶的“超活性”，萃取過程可以同時(shí)進(jìn)行蛋白質(zhì)酶法改性，從而為大豆蛋白和油脂的同時(shí)分離開辟一條具有良好應(yīng)用前景的新途徑。本文對(duì)酶增溶于反膠束的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀進(jìn)行了詳細(xì)的綜述，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

1 反膠束酶體系

1.1 反膠束體系

表面活性劑分子由親水基(極性頭)和疏水基(非極性尾)兩部分組成。正常膠束指將表面活性劑溶解在水中，并使其濃度超過臨界濃度(Critical Micelle Concentration，CMC)時(shí)，表面活性劑在水溶液中聚集到一起而形成聚集體，反膠束是指表面活性劑在超過臨界膠束濃度時(shí)溶于有機(jī)溶劑，在少量水的存在下，為幾納米到幾十納米［1］。此“水池”具有加溶蛋白質(zhì)和氨基酸等極性物質(zhì)的能力，形成的納米尺度聚集體。在這個(gè)聚集體的中心有一個(gè)小“水池”，一般本文所提及的“加溶”指水(或溶液)進(jìn)入反膠束極性核中，或指蛋白質(zhì)溶解于反膠束的“水池”中。反膠束的形狀可能為球狀、橢球狀或圓柱狀［2］。

圖1 正常膠束與反膠束示意圖

當(dāng)反膠束溶液與蛋白質(zhì)水溶液或含蛋白質(zhì)的固相接觸后，蛋白質(zhì)可加溶于反膠束的“水池”中，稱為前萃取(或前萃，F(xiàn)orward Extration)(圖2)。將含有蛋白質(zhì)的反膠束溶液與另一水相接觸，通過改變條件使蛋白質(zhì)從反膠束相轉(zhuǎn)移到水相中從而分離出蛋白質(zhì)，稱為后萃取(或后萃，Backward Extration) (圖3)。由于周圍水層和極性頭的保護(hù)，蛋白質(zhì)失活或變性程度很小。

1.2 反膠束酶體系制備和影響因素

反膠束體系具有三種溶解環(huán)境:連續(xù)有機(jī)相、膠束界面和膠束水池。它類似于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，使在其中的酶保持原有活性，甚至有時(shí)使酶表現(xiàn)出超活性。有機(jī)溶劑參與的酶催化反應(yīng)常用于該體系，酶增溶于反膠束體系方法主要有注入法、液體萃取法和固體萃取法等。

圖2 前萃過程

圖3 后萃過程

a.注入法:這是將含有酶的緩沖溶液注入到表面活性劑有機(jī)溶劑中，然后攪拌至形成透明溶液而形成反膠束酶體系的一種常用方法，該方法可很好地控制反膠束的水含量(w0)。

b.液體萃取法:是將酶從主體水溶液中轉(zhuǎn)移到含有表面活性劑反膠束溶液中而形成反膠束酶體系的另一種方法。通常，該法制得反膠束酶的濃度較高。

c.固體萃取法:它是將反膠束溶液和固體酶直接混合攪拌，使酶進(jìn)入反膠束體系的一種方法。該法使酶失活嚴(yán)重，一般很少使用。

圖4 反膠束酶體系示意圖

一般認(rèn)為，酶在反膠束中的溶解作用，與酶表面電荷同反膠束表面電荷靜電作用及反膠束大小有關(guān)。所以，任何可增強(qiáng)這種靜電作用或?qū)е滦纬奢^大反膠束的因素，均有利于酶在反膠束中溶解。實(shí)驗(yàn)表明，影響反膠束酶體系形成因素有表面活性劑種類和濃度、體系中水含量、水相酸堿度、水相離子強(qiáng)度和酶分子大小等［3］。

1.3 反膠束酶體系結(jié)構(gòu)及優(yōu)點(diǎn)

1.3.1 反膠束酶體系結(jié)構(gòu) 目前，脂肪酶和蛋白酶是研究最廣的兩種酶。關(guān)于酶增溶于反膠束中機(jī)理有三種不同結(jié)構(gòu)模型(圖5):Luisi水殼模型(water shellmode1)［4］、Martinek誘導(dǎo)適合模型(induced fitmode1)［6］、固定尺寸模型(fixed-sizemode1)［5］。

a.水殼模型:Rmp＞Rm，rmp＞rp;b.誘導(dǎo)適合模型:Rmp＞Rm，rmp=rp(rp＞rm);c.固定尺寸模型: Rmp=Rm(rp≤rm)。

Rmp:含酶膠束直徑;Rm:未填充膠束直徑;rm:未填充膠束水池直徑;Rmp:含酶水池直徑;rp:酶分子直徑［6］。

由圖2可知，電壓互感器1、2、3、4、5、6、7、8、9和11號(hào)A相的量測(cè)數(shù)據(jù)序列之間的平均歐氏距離均小于閾值，而電壓互感器10的量測(cè)數(shù)據(jù)序列與上述電壓互感的量測(cè)數(shù)據(jù)序列的平均歐氏距離大于閾值，由此可以判定電壓互感器10，也就是賓敘一線A相的電壓互感器發(fā)生故障。

圖5 酶增溶于反膠束中的結(jié)構(gòu)模型圖

1.3.2 反膠束作為酶增溶反應(yīng)介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn) 組成的靈活性;熱力學(xué)穩(wěn)定性和光學(xué)透明性;反膠束有非常高的界面積/體積比，遠(yuǎn)高于有機(jī)溶劑/水兩相體系，使底物和產(chǎn)物的相轉(zhuǎn)移變得極為有利;產(chǎn)物回收可通過相調(diào)變實(shí)現(xiàn)。反膠束的相特性隨溫度而變化，這一特性可用于產(chǎn)物回收。

2 反膠束酶體系增溶作用的研究進(jìn)展

1977年，Martinek［7］等研究了胰凝乳蛋白酶在丁二酸二辛酯磺酸鈉(AOT)反膠束體系中的性質(zhì)，這是關(guān)于反膠束酶學(xué)的正式研究報(bào)道。

到了20世紀(jì)90年代，反膠束技術(shù)被越來越廣地應(yīng)用在食品行業(yè)。CHEN J P［8］用卵磷脂/奶油反膠束系統(tǒng)來酶水解奶油，得到的產(chǎn)品風(fēng)味良好，且體系為食用級(jí)，代表了今后在食品科學(xué)上應(yīng)用的方向，同時(shí)也開發(fā)出一些價(jià)格較低的反膠束體系［9-10］。

由于反膠束用于酶增溶作用介質(zhì)具有組成靈活、熱力學(xué)穩(wěn)定和光學(xué)透明，有利于產(chǎn)物和底物相轉(zhuǎn)移及產(chǎn)物回收等很多優(yōu)點(diǎn);學(xué)者在蛋白質(zhì)的萃取分離和酶的固定化方面進(jìn)行了深入研究。Wei Li等人利用反膠束合成α-胰凝乳蛋白酶/聚乙烯吡咯烷酮復(fù)合物，即將α-胰凝乳蛋白酶固定化，這樣使得其酶活要高于純酶的活性［11］。Manav B.Bera［12］用反膠束提取淀粉酶，得出表面活性劑AOT的濃度、KCl的濃度對(duì)淀粉酶的提取影響顯著，而pH對(duì)其幾乎沒影響;得出最佳的工藝條件:pH、AOT的濃度、KCl的濃度依次為10.43、0.05、1.00，提取率可達(dá)83.16%。

同時(shí)，一些學(xué)者介紹利用反膠束體系進(jìn)行酶的純化并研究反膠束體系中酶的增溶作用，Konstantza Tonova［13］等介紹利用反膠束體系進(jìn)行酶的純化并研究反膠束體系中酶的增溶作用，闡述α-淀粉酶和脂肪酶的純化與增溶作用。Rashid O.Anarbasev［14］等研究反膠束體系中DNA β-聚合酶在反膠束體系中的活性被提高，從而證明微環(huán)境對(duì)DNA β-聚合酶的活性有重要的影響。Camille J.Roche［15］等利用反膠束體系研究蛋白的水化特性，證明反膠束體系可以模擬活的細(xì)胞環(huán)境進(jìn)行蛋白水化特性等研究。K.E. Nandini，Navin K.Rastogi對(duì)CTAB反膠束萃取脂肪酶的各種影響參數(shù)進(jìn)行了研究，得到脂肪酶的活力、提取效率及純化倍數(shù)分別為82.72%、40.27%、4.09［16］。

另外，超活性一直是酶在反膠束體系中研究的主要方面。國內(nèi)八十年代末期開始有翻譯介紹一些反膠束技術(shù)的文獻(xiàn)。此后，國內(nèi)開始有反膠束萃取氨基酸、酶、蛋白質(zhì)的報(bào)道。陸強(qiáng)、李寬宏［17］等人以CTAB/正己醇/正辛烷反膠束萃取體系，研究從水溶液中萃取牛血清白蛋白的動(dòng)力學(xué)，測(cè)定了多種條件下的表觀傳質(zhì)系數(shù)，從而判定萃取和反萃取過程各自的控制步驟。

20世紀(jì)末期到21世紀(jì)初，國內(nèi)的學(xué)者對(duì)酶在反膠束中的超活性進(jìn)行了主要研究，并對(duì)其影響因素進(jìn)行探討。楊宏順［18］的研究表明，在反膠束體系中，蛋白酶與反膠束相互作用，表現(xiàn)出“超活性”，并建立了反膠束中酶的動(dòng)力學(xué)模型。以全脂豆粉為原料，在不加酶的情況下蛋白一次萃取率為49.2%，在加入蛋白酶后，蛋白一次萃取率達(dá)到60%左右。苑艷輝［19］等對(duì)AOT/異辛烷反膠束體系萃取豆豉纖溶酶的前萃工藝進(jìn)行了研究，酶活回收率62.9%，純化倍數(shù)8.5。許林妹［20］等研究了Gemini型陽離子表面活性劑反膠束體系萃取纖維素酶，萃取率達(dá)90%以上，酶活達(dá)到121.41%。Yun Zhang［21］等研究發(fā)現(xiàn):木質(zhì)素過氧化物酶在GGDE/TritonX-100-環(huán)己烷-H2O反膠束體系中催化活性比在AOT反膠束體系中高40倍。

近年來，國內(nèi)學(xué)者在蛋白質(zhì)的萃取分離和酶的固定化方面也進(jìn)行了深入研究。柳暢先［22］等報(bào)道了用反膠束體系固定化醇脫氫酶(ADH)的研究，在此體系中，以十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)作為表面活性劑，辛烷和己醇作為溶劑及助溶劑。考察了ADH固定化的影響因素，確立了最佳固定化條件。姜崇斌等［23］利用堿性蛋白酶在十二烷基磺酸鈉(SDS)/異辛烷/正辛醇反膠束體系萃取蛋白的同時(shí)對(duì)蛋白進(jìn)行酶解，研究了堿性蛋白酶的加入對(duì)萃取的影響，確定了最佳工藝。庹潯［24］等研究十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)-辛烷-己醇反膠束體系對(duì)乳酸脫氫酶(LDH)進(jìn)行固定化，考察了含水量、CTAB和己醇濃度對(duì)LDH固定化的影響并得出最佳工藝條件，表明反膠束固定化LDH具有較好的熱穩(wěn)定性。

3 增溶于反膠束中的酶的動(dòng)力學(xué)規(guī)律

目前，已報(bào)道多種反膠束體系中的酶增溶作用動(dòng)力學(xué)模型。這些模型可歸為擴(kuò)散模型和非擴(kuò)散模型兩類，其差別在于是否考慮擴(kuò)散(diffusion)問題，也就是底物分子與酶分子分處于不同反膠束微粒中是否會(huì)影響或阻礙酶增溶反應(yīng)的進(jìn)行。

擴(kuò)散模型由Verhaert和Oldfield提出，假設(shè)酶在反膠束內(nèi)其動(dòng)力學(xué)本征參數(shù)不變，酶在反膠束內(nèi)行為的變化由底物接近程度的限制(擴(kuò)散因素)引起。實(shí)際上酶在反膠束內(nèi)獲得底物的方式是反膠束的融合，而這種物質(zhì)交換的速率遠(yuǎn)快于酶的反應(yīng)速率。

非擴(kuò)散模型由Kabanov和Bru提出，認(rèn)為酶在反膠束內(nèi)構(gòu)象的變化導(dǎo)致動(dòng)力學(xué)本征參數(shù)的變化。Kabanov假說反膠束存在最佳的大小使酶活力表達(dá)最高;Bru假說酶在反膠束體系的不同部位(自由水、束縛水、表面活性劑疏水尾和有機(jī)溶劑)時(shí)，表現(xiàn)的活力不同。這些假說都缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持，而且引入?yún)?shù)較多，難以測(cè)定，所以迄今為止關(guān)于酶在反膠束內(nèi)動(dòng)力學(xué)規(guī)律的理論解釋仍有爭(zhēng)議。不過實(shí)際過程中，使用的底物濃度遠(yuǎn)小于反膠束濃度，引起局域化濃度效應(yīng)，這至少是反膠束內(nèi)酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)變化的一個(gè)原因。

從表面上看，在反膠束體系中的酶增溶作用與在水溶液中沒有太大區(qū)別，也就是說，反膠束體系不能促進(jìn)或阻礙反應(yīng)中間態(tài)的形成。但是，在反膠束體系中對(duì)酶增溶反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)研究是很困難的，所以，目前僅采用穩(wěn)態(tài)法來測(cè)定Km與kcat值。

如果假定底物主要存在于核心水團(tuán)中，則底物濃度可有兩種表示，即表觀濃度 (overallconcentration)與水相濃度(waterpool-concentration)，故Km也有Km，overall與Km，waterpool之分，由于對(duì)核心水團(tuán)的直接研究較為困難，大多數(shù)報(bào)道的是表觀Km。對(duì)于水溶性底物來說，由于核心水團(tuán)的體積很小，底物被濃縮許多倍，Km，overall比水溶液中的Km，bulk有所降低，這似乎是可以預(yù)見的現(xiàn)象。但是實(shí)際上在許多情況下，Km，overall反而增加，例如對(duì)于反膠束體系中的胰蛋白酶，當(dāng)表面活性劑與底物所帶電荷相反時(shí)，Km，overall比Km，bulk增大很多。對(duì)于反膠束體系中的酶來說，其Km值與酶和反膠束的種類、增溶水量都有關(guān)，酶所表現(xiàn)出來的活性更接近于生物體環(huán)境。此時(shí)決定酶活性大小的是能與酶分子接觸的、能維持酶催化反應(yīng)的底物量，而不是總體系中的底物的多少，此時(shí)的Km反映的也不僅是酶分子與底物之間的作用，而且包括微環(huán)境對(duì)底物的影響。

Nishiki［25］等研究了在AOT/異辛烷反膠束體系溶菌酶和苯丙氨酸通過液-液界面時(shí)前萃與后萃的傳質(zhì)特征。

楊宏順［26］在研究反膠束中中性蛋白酶 AS1· 398反應(yīng)機(jī)理中得到:實(shí)驗(yàn)條件下反膠束中中性蛋白酶AS1·398的米氏常數(shù)約比水相中米氏常數(shù)小1個(gè)數(shù)量級(jí)，模型推導(dǎo)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果很接近，說明該模型可用于反膠束中以SPI為底物的AS1·398酶反應(yīng)。

Yang Liu［27］等人指出，溶菌酶在AOT/異辛烷反膠束體系中的前萃與后萃過程與在邊界層內(nèi)的擴(kuò)散阻力和在界面上的釋放過程密切相關(guān)。

María A.Biasutti［28］等人研究酶增溶在表面活性劑中的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，對(duì)其增溶過程的各種影響參數(shù)進(jìn)行分析，并強(qiáng)調(diào)了酶增溶于水相和有機(jī)溶劑過程中相似點(diǎn)和不同點(diǎn)。同時(shí)用目前存在的模型對(duì)其結(jié)果進(jìn)行解釋。

由于反膠束體系的組成相對(duì)于水溶液要復(fù)雜得多，必須同時(shí)考慮核心水團(tuán)、表面活性劑分子膜及有機(jī)溶劑對(duì)酶促反應(yīng)的影響，因此，提出的模型也較為復(fù)雜，關(guān)于酶增溶于反膠束中的動(dòng)力學(xué)和機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)語

由于反膠束用于酶增溶作用介質(zhì)具有組成靈活、熱力學(xué)穩(wěn)定和光學(xué)透明，有利于產(chǎn)物和底物相轉(zhuǎn)移及產(chǎn)物回收等很多優(yōu)點(diǎn);同時(shí)，也為親水性酶、相對(duì)疏水酶及疏水性底物或產(chǎn)物提供非常高的界面積/體積比，是一種新的生物催化劑固定化技術(shù)，近年來國內(nèi)外學(xué)者在蛋白質(zhì)的萃取分離和酶的固定化和分離純化方面進(jìn)行了深入研究，多傾向于陰離子表面活性劑的應(yīng)用［29-30］。以往的研究多集中在基礎(chǔ)方面，現(xiàn)已開始從基礎(chǔ)研究過渡到反膠束中酶增溶作用在藥物、食品添加劑、高分子材料的合成和有毒物質(zhì)的降解等方面的應(yīng)用研究［31-33］。

科研者對(duì)反膠束萃取氨基酸、酶等的影響因素、工藝過程作了相應(yīng)的研究，取得了較大的進(jìn)展［34-38］，證明該技術(shù)作為分離提純生物活性物質(zhì)的一項(xiàng)新技術(shù)，不僅具有許多優(yōu)越性，而且是可行的。但所涉及的大部分是小分子成分［39-40］(如ɑ-淀粉酶、溶菌酶等)，且其研究主要局限在液液萃取方面，而酶在反膠束體系中的增溶作用(液固分離)機(jī)理的研究報(bào)道尚少。此外，超活性一直是酶在反膠束體系中研究的主要方面。相信隨著對(duì)膠束酶學(xué)基本理論研究的不斷深入，通過研究增溶溶解于反膠束中的酶的動(dòng)力學(xué)規(guī)律，可以闡明不同反膠束的微環(huán)境中酶活力的表達(dá)，以及底物和產(chǎn)物分配對(duì)酶活力發(fā)揮的影響，另外通過探索反膠束體系中酶增溶作用和對(duì)蛋白質(zhì)改性的“超活性”作用機(jī)理，可以探討出蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)和分子量大小與反膠束“水池”微觀結(jié)構(gòu)(“水池”體積、形狀等)相互關(guān)系的規(guī)律，為探討反膠束體系中酶增溶作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)，從而實(shí)現(xiàn)而且將加快反膠束中酶增溶作用的工業(yè)化應(yīng)用。

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Research advances in enzyme solubilization reaction in reverse micelle

SHI Dong-mei，CHEN Fu-sheng*，ZHAO Jun-ting，YANG Hong-shun
(Henan University of Technology，Zhengzhou 450052，China)

The system of reverse micelles containing enzyme preparation methods and influencing factors，the structure model of enzymes dissolved in reverse micelles was discussed in this paper.And the newest study on development of enzyme solubilization reaction in reverse micelles was introduced and the prospect was given for its application.

reverse micelles;enzyme solubilization;surfactant

TS201.2+5

A

1002-0306(2011)03-0424-05

2010-03-09 *通訊聯(lián)系人

時(shí)冬梅(1985-)，女，研究生，研究方向:食品資源開發(fā)與利用。

國家自然基金項(xiàng)目(20976037);國家教育部科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)資助項(xiàng)目(205094);河南省杰出人才創(chuàng)新基金項(xiàng)目(05210005000)。