李 霞，劉靄珊，徐來祥，趙亞華

(1 華南農業(yè)大學生命科學學院，廣東廣州 510642;2 曲阜師范大學生命科學學院，山東曲阜 273165）

哺乳動物防御素具有廣泛的抗性譜，可以抗細菌、真菌、被膜病毒，甚至對支原體、衣原體、螺旋體及腫瘤細胞和愛滋病病毒也有殺傷作用［1-2］.此外，防御素還可啟動獲得性免疫系統(tǒng)，因此越來越受到人們的關注.哺乳動物的免疫系統(tǒng)包括特異性和非特異性免疫.非特異性免疫對各種入侵機體內的微生物在最初反應中起關鍵作用，哺乳動物防御素(Defensins)是其非特異性免疫的主要成分，存在于多形核粒細胞和上皮組織內，如人、大鼠、豚鼠、兔的嗜中性粒細胞及人和小鼠的小腸潘氏細胞內［3］.防御素富含Cys，在分子內形成二硫鍵，根據其分子內二硫鍵的連接位置不同可分為α-防御素和β-防御素［4］.α-防御素由 29 ～36 個氨基酸(aa)組成，分子內含6個保守半胱氨酸形成的3對二硫鍵，連接位點分別為 Cys1-Cys6、Cys2-Cys4 和 Cys3-Cys5［5］.二硫鍵可使小分子防御素分子致密以防蛋白酶水解，致使防御素在吞噬溶酶體環(huán)境中能保持活性.在兔中性粒細胞(Rabbit neutrophil peptide，NP)中分離到6種 α-防御素的陽離子抗菌肽:NP-1、NP-2、NP-3a、NP-3b、NP-4、NP-5，長度均約 32-34 個 aa，富含 Cys和Ary，每種防御素都含3個分子內二硫鍵.比對它們的aa組成，其序列高度保守，對其生物學活性及結構有重要的作用.2003年徐文生等［6］對NP-1進行過原核表達，表達量占細菌總蛋白的34.7%.本研究采用畢赤酵母Pichia pastoris表達系統(tǒng)對pNP-1基因及其串聯(lián)基因進行表達，表達出的多價串聯(lián)體的重組蛋白經溴化氰切割，將得到的產物進行抑菌試驗，初步研究兔防御素的抑菌機理.

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

Pichia pastoris GS115菌株、pPICZα-A質粒購于Invitrogen公司;常規(guī)克隆宿主菌大腸埃希菌Escherichia coli DH5α，抗菌活性檢測菌株大腸埃希菌K12D31、白色念珠菌Candida albicans、靈菌Serratia macrescens、枯草桿菌Bacillus subtilis、金黃葡萄球菌Staphylococcus aureus及蘇云金桿菌Bacillus thuringiensis均由華南農業(yè)大學生命科學學院生化實驗室保存.

1.2 酶與試劑

Taq DNA聚合酶，CIAP堿性磷酸酶，T4DNA連接酶，限制性內切酶 EcoRⅠ、SalⅠ、XhoⅠ、SacⅠ 購自大連寶生物工程公司;腸激酶購自NOVAGEN公司;質粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司;Zeocin、PVDF超濾膜和ProBond蛋白純化試劑盒購自Invitrogen公司;引物合成及測序由上海英駿生物公司完成;其余試劑均為進口或國產分析純.

1.3 pNP-1基因及其串聯(lián)基因的設計

根據畢赤酵母密碼子偏愛性重編兔防御素基因后的pNP-1基因序列:5'-CGCGAATTCGTCGTCTGTGCTTGTAGAAGAGCTTTGTGTTTGCCAAGAGAAAGAAGAGCTGGTTTCTGTAGAATCAGAGGTAGAATCCACCCATTGTGCTGCAGAAGAGTCGACCGC-3'(下劃線為EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點).根據已調整的pNP-1序列，使用 Primer Priemir 5.0設計4條搭橋引物pNP-1(1)、pNP-1(2)、pNP-1(3)和 pNP-1(4)，用于合成pNP-1序列.

利用PCR的方法在pNP-1基因5'端加上XhoⅠ酶切位點及蛋氨酸密碼子ATG，在3'端加上SalⅠ酶切位點，合成pNP-1的串聯(lián)基因［pNP-1(2×)］和［pNP-1(3×)］.引物序列見表1.

表1 引物序列Tab.1 List of primers

1.4 pNP-1基因與其串聯(lián)基因的合成與擴增

1.4.1 pNP-1基因的合成及重組質粒 pPICZaA-pNP-1的構建 4條搭橋引物作為模板進行PCR，PCR循環(huán)參數:94℃ 2 min，94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 40進行25個循環(huán)，72℃ 2 min.取上步產物作為模板，用pNP-1(1)和pNP-1(4)為引物進行第2次PCR擴增，程序為:94℃ 2 min，94℃ 30 s、52℃30 s、72℃ 40 s進行25個循環(huán)，72℃ 10 min.瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化后得到pNP-1基因.

將pNP-1基因與載體pPICZα-A均經EcoRⅠ和SalⅠ酶切后回收，連接，轉化E.coli DH5α.將此克隆的重組質粒命名為 pPICZaA-pNP-1.用 AOXⅠ和pNP-1(1)(表1)作為引物進行菌落PCR檢測.

1.4.2 pNP-1串聯(lián)基因的合成 以pPICZα-A-pNP-1重組質粒為模板，將pNP-1基因串聯(lián)的正向和反向引物(表1)進行PCR反應合成串聯(lián)基因pNP-1(2×)，以此類推得到pNP-1(3×).PCR反應程序:94℃ 5 min，94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s進行25 個循環(huán)，72℃ 10 min.瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化后得到pNP-1(2×)和pNP-1(3×).

1.4.3 pNP-1多價串聯(lián)重組質粒的構建 pPICZaA-pNP-1重組質粒經SacⅠ單酶切消化后CIAP去磷酸化;pNP-1串聯(lián)基因經XhoⅠ和SalⅠ雙酶切，連接轉化E.coli DH5α.將此雙拷貝重組質粒命名為pPICZaA-pNP-1(2×).同樣在 pPICZaA-pNP-1(2×)基礎上構建pNP-1三拷貝基因重組質粒pPICZaA-pNP-1(3×).

1.5 多倍體酵母重組質粒的構建

3種重組質粒分別經SacⅠ酶切線性化.電轉畢赤酵母 GS115 感受態(tài)細胞(2.0 kV，25 μF ，200 Ω).30℃培養(yǎng)72 h.重組質粒使用AOXⅠ和pNP-1(4)通過菌落PCR鑒定.PCR反應程序:94℃ 10 min，(94℃ 30 s，50℃ 30 s，72 ℃ 50 s)30個循環(huán)，72 ℃10 min.產物進行10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳觀察鑒定.

1.6 重組酵母誘導表達后重組蛋白檢測及純化

分別選取生長最旺盛的3種重組酵母菌進行甲醇誘導表達.挑取單菌落接種于BMGY培養(yǎng)基中，誘導培養(yǎng)72 h后停止，離心收集上清，使用三氯乙酸(TCA)沉淀法初步濃縮上清，Tricine-SDS-PAGE檢測.大量表達重組蛋白使用硫酸銨沉淀法沉淀，取沉淀溶解.將溶解后的樣品使用Sephadex-G25凝膠過濾脫鹽.對于多倍體重組蛋白而言，上述操作后還需進行鎳柱純化.純化樣品經Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳檢測.

1.7 單體與多倍體裂解后的蛋白抑菌效價測定

將1.6得到的多倍體重組蛋白使用CNBr進行特異水解，冷凍干燥備用抑菌試驗.

1.7.1 瓊脂擴散法和稀釋法測定抑菌效價 取純化后的單體蛋白和多倍體裂解后樣品，加ddH2O溶解備用.制備指示菌(金黃葡萄球菌，大腸埃希菌K12D31，枯草桿菌，蘇云金桿菌、白色念珠菌、靈菌)菌懸液.配制LB及PDA半固體培養(yǎng)基平板.分別取菌懸液200 μL涂布于相應的半固體平板上.待平板完全吸收菌液后，取滅菌的濾紙片放置在平板上，分別浸潤5、10、20和40 μL的樣品，待樣品溶液被平板完全吸收后，放置于37℃培養(yǎng)12 h.觀察抑菌情況.

取瓊脂糖擴散法中菌懸液，10倍倍比稀釋109倍，取5、10、15、20 和25 μL 涂布固體培養(yǎng)基，記錄各板生長的菌落數，計算出菌液的每毫升單位菌落總數(CFU/mL).此外，將菌懸液稀釋至105CFU/mL，分別取 50 μL 于 96 孔板，加入樣品液 0、2、4、6、8 和10 μL，再加入無菌水補至10 μL總體積，37℃培養(yǎng)2 h全部取出涂布半固體平板，37℃過夜.計算平板上生長的菌落，算出細菌存活率.

1.7.2 多種抗生素對pNP-1抗金黃葡萄球菌抑菌效價的影響 取氨芐青霉素、鏈霉素、氯霉素、卡那霉素、利福平、新生霉素和四環(huán)素，用上述各抗生素的5倍最低抑菌濃度［6］，對處于對數生長期(107CFU/mL)的金黃葡萄球菌處理1 h，離心沉淀菌體，用PBS洗凈，并用LB培養(yǎng)基稀釋菌濃度至105CFU/mL，分別取50 μL 稀釋后菌液于96 孔板，加入在菌懸液0、2、4、6、8和10 μL，補水至10 μL總體積，37 ℃培養(yǎng)2 h后測定細菌存活率.以未用抗生素處理的菌體作對照.

2 結果與分析

2.1 pNP-1單基因的合成

pNP-1單基因的PCR擴增，電泳如圖1所示，第1、2、3泳道均有一條約100 bp的電泳譜帶，與預期的pNP-1基因大小117 bp相符.

圖1 pNP-1基因的PCR合成Fig.1 PCR amplification of pNP-1 gene

2.2 3種重組質粒的PCR鑒定

3種重組質粒轉化DH5a的單菌落進行菌落PCR，電泳結果見圖 2.泳道 1、2、3 分別與 pNP-1、pNP-1(2×)和pNP-1(3×)的預期大小456、556和656 bp相符，說明重組質粒中存在有不同拷貝數的目的片段.

2.3 pNP-1及其重組子重組酵母的菌落PCR鑒定

3個基因轉化GS115后長出的酵母單菌落PCR后電泳結果如圖3.3個基因重組酵母與其重組DH5a的菌落PCR結果基本一致，說明重組質粒已經成功整合進入酵母基因組中.

圖2 pNP-1及其多串聯(lián)體重組子轉化大腸埃希菌后的菌落PCR鑒定Fig.2 Identification of pNP-1，pNP-1(2 × )and pNP-1(3 × )recombination plasmids by PCR in Escherichia coli

圖3 pNP-1及其多串聯(lián)體重組子轉化GS115后的菌落PCR鑒定Fig.3 Identification of pNP-1，pNP-1(2×)and pNP-1(3×)by colony PCR in GS115

2.4 pNP-1重組酵母的甲醇誘導表達

對誘導表達的重組蛋白進行Tricine-SDS-PAGE，結果見圖4，pNP-1、pNP-1(2×)和 pNP-1(3×)重組蛋白相對分子質量(Mr)約與Marker上5000、9000和13000相對應，與其重組蛋白的理論Mr5490、9380、13270大小基本相符.

用 Bandscan 5.0軟件計算 pNP-1、pNP-1(2×)和pNP-1(3×)重組蛋白的表達量分別為21.6%、30.7%和41.8%.表達上清液經考馬斯亮藍G250法測定總蛋白質量濃度分別為15.7、20.8和31.2 mg/L，總體積為100mL.由此得知重組蛋白在發(fā)酵液中的質量濃度分別為3.39、6.39和13.05 μg/mL.

圖4 重組酵母的甲醇誘導表達Fig.4 Induced expression of pNP-1，pNP-1(2 × )and pNP-1(3×)by methanol in recombinant GS115

2.5 pNP-1重組蛋白的濃縮與純化

2.5.1 硫酸銨沉淀濃縮重組蛋白 硫酸銨沉淀濃縮后的 pNP-1、pNP-1(2×)和 pNP-1(3×)進行Tricine-SDS-PAGE后結果如圖5所示.重組蛋白條帶單一，與Marker上Mr約5000、9000和13000的條帶相對應，與其重組蛋白的理論值相符.

圖5 硫酸銨沉淀濃縮后的重組蛋白電泳圖Fig.5 Tricine-SDS-PAGE of recombined protein concentrated by ammonium sulfate

2.5.2 pNP-1多倍體重組蛋白的Ni柱純化 pNP-1(2×)和pNP-1(3×)重組蛋白經Ni柱純化后電泳結果如圖6所示，純化后的pNP-1(2×)，pNP-1(3×)重組蛋白基本只剩下Mr為9000和13000的組分，與預期大小相符.

圖6 純化的pNP-1(2×)和pNP-1(3×)重組蛋白電泳圖Fig.6 Tricine-SDS-PAGE of purified recombinant pNP-1(2 × )and pNP-1(3×)

2.5.3 多倍體重組蛋白的CNBr特異水解 經CNBr水解后凍干的pNP-1(2×)和pNP-1(3×)重組蛋白溶于ddH2O，電泳結果如圖7所示.由圖7可見，出現(xiàn)了Mr約為3800和5000的2條帶.其中Mr約為5000的帶較淺，為帶有表達載體上1600 bp的pNP-1重組蛋白，Mr約為3800的帶為CNBr水解下來的pNP-1蛋白.

圖7 水解［pNP-1(2×)］、［pNP-1(3×)］重組蛋白純化電泳圖Fig.7 Tricine-SDS-PAGE of hydrolyzation of recombined pNP-1(2×)and pNP-1(3×)by cyanogen bromide

2.6 重組pNP-1的抑菌試驗結果

瓊脂糖擴散法抑菌試驗結果顯示，pNP-1對蘇云金桿菌、金黃葡萄球菌、枯草桿菌等G+和大腸埃希菌K12D31等G-細菌均有明顯的抑菌作用，而對白色念珠菌沒有抑菌作用，對靈菌有輕微的抑菌作用.取瓊脂糖擴散法試驗中的孢子懸液10倍倍比稀釋后得到的菌液做指示菌存活率試驗，得到的pNP-1質量濃度與指示菌存活率關系如圖8所示，該圖中顯示的結果與瓊脂糖擴散法抑菌試驗結果相符合.

圖8 pNP-1質量濃度與指示菌存活率的關系Fig.8 The relationship between pNP-1 mass concentration and survival rate of indicator bacteria

經過抑菌數據的線性回歸分析，pNP-1對各菌的最小抑菌質量濃度分別為金黃葡萄球菌8.59 μg/mL，枯草桿菌 8.13 μg/mL，K12D318.46 μg/mL，蘇云金桿菌 10.63 μg/mL.

2.7 不同抗生素處理對重組pNP-1抑菌活性的影響

將經氨芐青霉素、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、新生霉素、四環(huán)素和利福平處理過的金黃葡萄球菌與不同濃度的pNP-1作用，得到7種抗生素對pNP-1抑菌活性影響的數據，如表2所示.細胞壁合成抑制劑氨芐青霉素處理后再培養(yǎng)2 h的金黃葡萄球菌的存活率比對照組下降了48.7%，添加了重組pNP-1之后，存活率比對照組平均下降了45.9%，說明pNP-1與氨芐青霉素都對金黃葡萄球菌有抑制作用，兩者之間的抑菌表現(xiàn)出同促效應.蛋白質合成抑制劑卡那霉素、氯霉素、鏈霉素和四環(huán)素處理2 h后的金黃葡萄球菌的存活率分別下降了59%、13%、28%和40.8%，再加入pNP-1處理后存活率均沒有出現(xiàn)顯著的下降，說明多種蛋白質合成抑制劑與pNP-1在抑菌方面沒有明顯的關系.RNA合成抑制劑利福平處理組的數據顯示，重組pNP-1對利福平產生同促效應.DNA合成抑制劑新生霉素處理組，經過不同濃度的重組pNP-1處理后，細菌存活率最大下降值為6.5%，與對照組相比其下降幅度較小.2種核酸合成抑制劑對重組pNP-1表現(xiàn)不同的效應.

表2 不同抗生素處理過的金黃葡萄球菌在不同質量濃度重組pNP-1蛋白下的存活率Tab.2 Survival rates of different antibiotic-treated Staphylococcus aureus under different mass concentrations of recombinant pNP-1 protein %

3 討論

圍繞兔防御素基因的表達，本研究實施了一系列有利于該基因表達的策略.目的基因中含過多的稀有密碼子被認為是低表達水平和產生不完全產物的一個原因［7-8］.盡管少量稀有密碼子的出現(xiàn)通常不會給目的蛋白的合成造成太大影響，但如果一個基因中含有成串或多個稀有密碼子，外源蛋白的表達水平將非常低.當在氨基端附近出現(xiàn)多個稀有密碼子時，情況更為嚴重［9］.根據畢赤酵母表達偏愛性優(yōu)化最適合表達的pNP-1基因，設計引物人工搭橋合成，使用同尾酶構建多串聯(lián)體在畢赤酵母中表達，明顯提高了重組蛋白的表達量.1996年Lee等［10］為擴大NP-1基因的表達量，嘗試使用E.coli表達各種的融合串聯(lián)多肽，這一方法使多肽的表達有顯著提高，但表達量的增加并未與串聯(lián)數的增長成正相關，特別是當串聯(lián)數較大時，串聯(lián)體的表達量反而降低.

限于試驗條件，本研究對于pNP-1在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達的所有數據都由搖瓶發(fā)酵獲得，而培養(yǎng)溫度、通氣量、培養(yǎng)基酸堿度、培養(yǎng)密度等培養(yǎng)條件對表達量均有重要的影響，這些因素只有在發(fā)酵罐發(fā)酵的條件下才能得到嚴格控制，因此pNP-1基因的畢赤酵母發(fā)酵表達的過程仍有待進一步的優(yōu)化.

很多研究都表明其作用位點不局限于只對細菌的膜結構，而更多是參與抑制細菌中核酸和蛋白合成的過程［11-14］.同時，也有研究［15-16］表明，防御素對細菌細胞膜的作用只是其整個抑菌過程的第1步，通過在細菌膜上形成穿孔或增加膜的通透性使其更容易進入細胞內部，并與細胞內的其他作用位點相互作用而進一步抑制細菌的生長.不同的抗生素有其特異的作用位點，對于防御素的作用機制，這也在本試驗中有所體現(xiàn)，但其具體作用機制還有待進一步研究.

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