敖 然，曾振靈，余靜賢，沈祥廣

(華南農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642）

二嗪農(nóng)是少數(shù)允許在獸醫(yī)上使用的有機磷農(nóng)藥中的一種.在畜牧業(yè)上，二嗪農(nóng)主要用于防治牛、羊、豬的螨、蠅、虱、蜱等體外寄生蟲病.我國和歐盟對二嗪農(nóng)在奶中規(guī)定了停藥期(棄奶期3 d)和最大殘留限量(MRLs 20 μg·kg－1).目前，國內用于監(jiān)測二嗪農(nóng)殘留的檢測方法主要集中在蔬菜、水果、肉食品等方面，檢測牛奶中二嗪農(nóng)殘留的文獻報道較少，尚未有專門用于測定奶中二嗪農(nóng)殘留的國家標準或行業(yè)標準.國內外有機磷農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有液相色譜 － 質譜聯(lián)用法［1］、薄層色譜法［2］、氣相色譜法［3］、氣相色譜 － 質譜聯(lián)用法［4］等.采用氣相色譜法結合火焰光度檢測器(FPD)具有特異性強、靈敏度高的特點.此外氣相色譜儀的儀器價位較低，幾乎在全國各級農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測機構和奶業(yè)企業(yè)均已普及.牛奶是一種比較理想的完全營養(yǎng)食品，已經(jīng)成為大眾飲食中不可缺少的一部分，它的安全和品質關系到廣大民眾的身體健康.該方法的建立將有利于奶業(yè)企業(yè)對原料奶的采購和產(chǎn)品的生產(chǎn)過程進行在線檢測，也有利于基層農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測機構就近對奶業(yè)企業(yè)及市場奶品的產(chǎn)品質量安全進行有效監(jiān)督.

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

二嗪農(nóng)標準品(德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批號:C12210000，純度97.5%);乙腈、丙酮、正己烷均為國產(chǎn)分析純;中性氧化鋁固相萃取柱.

1.2 儀器

Autosystem XL GC氣相色譜儀，配火焰光度檢測器(FPD)為美國Perkin-Elmer公司產(chǎn)品;J-25型冷凍高速離心機為德國Baeckman公司產(chǎn)品;旋轉蒸發(fā)儀;氮吹儀;KS501 digital軌道式搖床為德國 Hettich公司產(chǎn)品;分析天平(感量0.00001 g).

1.3 試液配制

二嗪農(nóng)標準貯備液:準確稱取0.01026 g二嗪農(nóng)標準品至100 mL容量瓶，用丙酮定容成為100 mg·L－1的二嗪農(nóng)標準貯備液.

二嗪農(nóng)標準溶液:根據(jù)需要精密吸取二嗪農(nóng)標準貯備液適量，用丙酮稀釋成質量濃度分別為20、50、100、500、1000、2000 μg·L－1的標準溶液.

1.4 色譜條件

色譜柱:DB-17石英毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm).不分流進樣.柱溫程序:初始溫度100℃，保持5 min，以 30℃·min－1升至 260℃，保持 6 min;進樣口溫度250℃;檢測器溫度 250℃;載氣(氮氣，純度≥ 99.999%)2.5 mL·min－1;燃氣(氫氣)70 mL·min－1;助燃氣(空氣)100 mL·min－1;進樣量 2 μL.

1.5 樣品的處理

1.5.1 樣品的提取 稱取牛奶10 g(精確至0.01 g)，置于 50 mL聚丙烯塑料離心管中，加丙酮 10 mL，搖勻，加入正己烷20 mL，蓋緊，置搖床振蕩 20 min，8000 r·min－1離心 10 min，上清液移入梨形瓶中，再往離心管中加入20 mL正己烷，重復上述提取步驟，上清液并入同一梨形瓶中，50℃減壓蒸干.

1.5.2 樣品的凈化 取中性氧化鋁固相萃取柱，加5 mL乙腈平衡，抽干;用5 mL乙腈渦旋溶解梨形瓶蒸干后的殘留物，過柱，加2 mL乙腈洗柱，抽干，收集過柱液和洗柱液于10 mL玻璃的離心管中，置50℃水浴中用氮氣吹干，用1 mL丙酮溶解吹干殘留物，進氣相色譜儀分析.

1.5.3 標準曲線制備 二嗪農(nóng)基質匹配標準溶液:移取相應質量濃度下的二嗪農(nóng)標準溶液1 mL溶解空白牛奶樣品處理后的殘留物，制得該質量濃度下的二嗪農(nóng)基質匹配標準溶液，進氣相色譜儀分析.

2 結果與分析

2.1 牛奶中二嗪農(nóng)的線性關系

取適量相應濃度二嗪農(nóng)基質匹配標準工作溶液，在“1.4”所述色譜條件下，二嗪農(nóng)保留時間約9.8 min.以二嗪農(nóng)的濃度對峰面積作線性回歸，線性方程為Y=0.015X－1.630，r=0.9999，式中Y表示二嗪農(nóng)質量濃度(μg·L－1)，X表示相應的峰面積響應值，r表示相關系數(shù).二嗪農(nóng)基質匹配標準溶液、空白牛奶樣品和空白牛奶添加樣品的色譜分析結果見圖1.

圖1 二嗪農(nóng)基質匹配標準溶液(0.1 μg·mL－1，a)、空白牛奶樣品(b)及空白牛奶添加樣品(10 μg·kg－1，c)的氣相色譜圖Fig.1 Chromatogram of diazinon matrix standard solution(0.1 μg·mL －1，a)，blank milk sample(b)and blank milk with diazinon sample(10 μg·kg－1，c)

2.2 檢測限

本方法的檢測限采用空白牛奶樣品添加標準溶液的方法進行實際測試，分別在 2.0、5.0 μg·kg－1水平進行測試，每批每一質量濃度重復測定5次，分別計算二嗪農(nóng)峰高/噪音(S/N)比值，共進行4批次，結果質量濃度為2.0 μg·kg－1的平均S/N為4.04 ±0.72(n=20);質量濃度為 5.0 μg·kg－1的平均 S/N 為11.4±1.02(n=20).確定了方法中二嗪農(nóng)檢測限為2.0 μg·kg－1(S/N≥ 3)，定量限為 5.0 μg·kg－1(S/N≥10).

2.3 回收率及變異系數(shù)

采用空白牛奶樣品添加標準溶液的方法進行添加回收率試驗，對方法的準確度進行測試.將適量不同質量濃度標準工作液各加入10 g空白牛奶樣品中，制得 5、10和 20 μg·kg－13 個添加水平的樣品，然后按樣品處理方法處理，進行色譜分析.每一批樣品均測定5次，共4批樣品.二嗪農(nóng)的回收率及變異系數(shù)見表1.

表1 牛奶中二嗪農(nóng)不同質量濃度的回收率和變異系數(shù)Tab.1 Recoveries and RSD of diazinon in milk at different concentrations

3 討論與結論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

二嗪農(nóng)是一種極性相對較小的脂溶性有機磷農(nóng)藥，經(jīng)試驗，采用硫磷檢測器(FPD)和中等弱極性的毛細管色譜柱(DB—17型號)進行分析對其具有較好的選擇性和靈敏度.檢測器溫度控制在250℃時，二嗪農(nóng)的響應峰較高，溫度上升，峰高有下降的趨勢.在本試驗所用柱溫程序條件下二嗪農(nóng)的色譜峰寬較窄，峰形高而對稱，空白牛奶試樣在二嗪農(nóng)色譜峰的保留時間附近無雜質峰干擾.進樣室溫度設置為250℃，有利于被測物質有效氣化，同時防止其在進樣室蓄積而干擾檢測，進樣室溫度下降或者升高，藥物的色譜峰峰高均有下降的趨勢.

3.2 樣品處理方法的選擇

3.2.1 提取與凈化 比較了極性較大的有機溶劑(乙腈、丙酮或乙醇等)［5－6］、極性較弱的有機溶劑(正己烷、乙酸乙酯或石油醚等)［7－9］來提取牛奶中的二嗪農(nóng).因為正己烷的沸點低，極性弱，提取后攜帶的雜質少，對提取二嗪農(nóng)有良好的選擇性;同時由于提取后的溶劑含水量很低，易于蒸餾濃縮，最終采用正己烷為提取溶劑.因牛奶中含有乳化成分，容易使正己烷被乳化，所以在10 g牛奶中先加入10 mL丙酮，使蛋白質變性，同時破壞乳化.

牛奶中含有乳脂，用正己烷提取后同時也帶入了脂肪，常用液液萃取或固相萃取方法進行凈化［10－11］.由于選用正己烷為提取溶劑，不宜采用液液萃取的方法除脂肪，故選用固相萃取法.經(jīng)對氧化鋁柱、C18柱、HLB柱和陽離子交換柱(SCX、MCX)等進行比較，使用1 g規(guī)格的中性氧化鋁固相萃取柱能較好去除脂肪，操作簡便，二嗪農(nóng)的回收率也較高，使用2 g規(guī)格的中性氧化鋁固相萃取柱，能更好去除脂肪，但回收率有所下降(約5%).

3.2.2 基質效應 據(jù)文獻報道，關于有機磷農(nóng)藥在蔬菜、水果、肉類等食品中殘留的氣相法檢測試驗中，樣品基質對許多有機磷農(nóng)藥色譜峰的響應值有增強效應［12－13］.在試驗中發(fā)現(xiàn)，同一濃度下，含基質的二嗪農(nóng)標準溶液的色譜峰面積約是用純丙酮配制的標準溶液的色譜峰面積的1.5倍.因此，檢測結果的計算采用歐盟推薦的基質匹配標準溶液校準法計算［14］，以抵消基質效應對檢測結果的干擾.

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