覃立立，童 雄，徐 建，張 豪，李加琪，王 翀

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點實驗室，廣東廣州 510642）

真核生物基因組中，只有約10% ～15%的基因在單個細(xì)胞中表達(dá)，因而從mRNA水平上研究差異表達(dá)的基因?qū)τ趶氖录倚笥N研究工作者是一項非常有意義的工作.Liang等［1］創(chuàng)立了mRNA差異顯示技術(shù)(DDRT－PCR)以研究 mRNA的表達(dá)差異.李盛霖等［2］利用該技術(shù)對福州黑豬、肉用型豬和其他雜種豬的肉質(zhì)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明福州黑豬的各項肉質(zhì)指標(biāo)均高于各引進(jìn)肉用型豬種，福州黑豬的肌肉pH為5.24±0.16，肌肉顏色評分為4.33±0.21，肌肉大理石紋評分為3.33±0.21，失水率為(19.28±5.49)%，肌纖維直徑為(43.05±6.12)μm.Lonergan等［3］認(rèn)為造成豬種生長和肉質(zhì)性狀差異的原因是高強(qiáng)度選育.李亮等［4］利用mRNA差異顯示技術(shù)對絲羽烏骨雞與快大型肉雞肝臟組織中差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，得到10條絲羽烏骨雞與快大型肉雞肝臟差異表達(dá)序列標(biāo)簽.Liu等［5］應(yīng)用DDRT－PCR技術(shù)研究大白、長白正反雜交組合與大白、梅山雜交組合之間背最長肌中基因表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)了一個與CO2水合作用相關(guān)的新基因，命名為豬的CA－Ⅲ基因.本研究利用mRNA差異顯示技術(shù)對廣東省地方品種藍(lán)塘豬和引進(jìn)品種大白豬達(dá)到經(jīng)濟(jì)成熟時的眼肌組織mRNA進(jìn)行比較.利用DDRT－PCR技術(shù)研究中外豬種肉質(zhì)性狀相關(guān)差異表達(dá)基因，探討造成中外豬種肉質(zhì)表型差異的分子機(jī)制，對于充分發(fā)揮地方品種和引入品種的遺傳優(yōu)勢、生產(chǎn)出更多滿足人們需要的產(chǎn)品具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 純種藍(lán)塘豬眼肌組織樣品采自廣東省板嶺原種豬場，共4頭(公母各半);純種大白豬也來自同一豬場，共4頭(公母各半).采集的2個品種豬均為達(dá)到體成熟的健康豬.

1.1.2 差異顯示引物 本研究所用的差異顯示引物由美國Iowa State University的Rothschild教授惠贈，錨定引物序列見表1，隨機(jī)引物序列見表2.

表1 差異顯示3′錨定引物序列Tab.1 3′anchor primer sequences of differential display

1.1.3 差異顯示條帶重擴(kuò)增所用引物 差異顯示條帶回收后重擴(kuò)增所用引物如表3所示.

1.1.4 主要試劑 TRIZOL Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品.Taq酶、dNTPs、低熔點的瓊脂糖、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin為 TaKaRa公司產(chǎn)品.DEPC、EDTA、TRIS、TEMED、去離子甲酰胺、過硫酸銨、硼酸、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、甘油均為上海生物工程有限公司產(chǎn)品.

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取 總RNA的提取按照Invitrogen公司的 TRIZOL Reagent使用說明進(jìn)行.用DNase－I處理以去除其中痕量的染色體DNA污染.

1.2.2 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 差異顯示PCR產(chǎn)物在非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離并拍照.

表2 差異顯示5′隨機(jī)引物序列Tab.2 5′random primer sequences of differential display

表3 差異顯示條帶重擴(kuò)增引物序列Tab.3 Re-amplified primer sequences of differential display bands

1.2.3 銀染顯帶 在銀染的每一步都要戴上干凈的手套，避免在膠板上留下指紋.步驟為凝膠板的分離、固定、凝膠染色、顯影、固定、拍照.

1.2.4 差異顯示條帶回收與重擴(kuò)增 用潔凈的手術(shù)刀片將凝膠上的差異條帶切下，放入0.5 mL的離心管中，加入 50 μL雙蒸水，煮沸 15 min，然后在4℃、8000 r/min離心1 min，吸取上清液，－20℃保存.取上述回收產(chǎn)物1 μL做模板，用與第一次PCR相同的反應(yīng)體系，分別用T7 promoter和M13rev－48p作為重擴(kuò)增的上下游引物，進(jìn)行PCR.PCR反應(yīng)程序為:94℃變性5 min后，按94℃ 30 s、60℃ 40 s、72℃ 1 min共進(jìn)行30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min.

1.2.5 測序 將差異表達(dá)ESTs的PCR產(chǎn)物送交上海英駿生物技術(shù)有限公司測序.

2 結(jié)果

2.1 差異顯示結(jié)果

2.1.1 差異顯示ESTs的重復(fù)性 為了便于直觀地顯示出差異表達(dá)的條帶，并且保證有差異的條帶具有可重復(fù)性，本試驗在電泳時，將2個重復(fù)樣品連續(xù)點樣，同一對引物組合4個樣品平行上樣，如圖1所示.其中 ESTsp7在大白豬種中表達(dá)量高，而ESTsp8、ESTsp9、ESTsp10、ESTsp11在大白豬中表達(dá)量低.差異顯示結(jié)果見表4.

圖1 差異顯示PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.1 Differential display PCR in polyacrylamide gel electrophoresis

2.1.2 差異顯示ESTs測序結(jié)果 本研究得到的差異顯示ESTs測序結(jié)果見表5.

2.1.3 差異顯示條帶的重擴(kuò)增 對差異比較明顯的目的條帶回收后，以回收產(chǎn)物作模板進(jìn)行PCR，其產(chǎn)物用普通瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到特異性的條帶(圖2).

表4 5條差異顯示的ESTsTab.4 Five differential display ESTss

圖2 差異條帶重擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Differential band re－amplification in gel electrophoresis

表5 ESTs測序結(jié)果Tab.5 Sequencing results of ESTs

2.1.4 相似性比對結(jié)果 將差異顯示PCR得到的5條ESTs序列與GenBank上已知序列進(jìn)行對庫檢索，結(jié)果表明:ESTsp7序列與細(xì)胞色素c氧化酶亞單位Ⅲ基因在473 bp的范圍內(nèi)相似性達(dá)到100%，而ESTsp9、ESTsp10、ESTsp11均與豬 SLN 基因相似性達(dá)到了94% ～95%，表明這3段ESTs位于豬SLN基因的不同位置.ESTsp8未搜索到相似基因.

3 討論

Janzen 等［6］利用 DD RT－PCR 的方法鑒定了一個經(jīng)過選擇純化的品系和一個隨機(jī)的對照品系的背最長肌的差異表達(dá)基因，分離和鑒定了一條在選擇品系的背最長肌中有很高表達(dá)量的590 bp的cDNA，該cDNA與牛的相對分子質(zhì)量為16000的cAMP－調(diào)控磷蛋白(Regulated phosphoprotein，ARPP－16)cDNA序列的3'－非轉(zhuǎn)錄區(qū)有89%的相似性.對豬的ARPP－16的RT－PCR擴(kuò)增和測序證實DD法得到的cDNA是豬的 ARPP－16轉(zhuǎn)錄子的3'末端.半定量PCR分析表明ARPP－16在選擇品系中表達(dá)量比對照品系提高了4倍(P＜0.01)，表明 ARPP－16可能是調(diào)控豬骨骼肌生長的一個重要的基因.銀巍等［7］應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)獲得164個在大鼠小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型中差異表達(dá)的ESTs，對其中的17個ESTs進(jìn)行了克隆并測序，再通過反Northern雜交初步篩選得到 5 個陽性片段.Muráni等［8］用 DDRTPCR技術(shù)對胚胎期的皮特蘭和杜洛克骨骼肌轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行研究，對其中80個cDNA片段測序，43個與生長的時期相關(guān)，37個與豬種相關(guān)，在得到的85條特異ESTs中，有52條位于已知的基因上.Mario等［9］用DDRT－PCR技術(shù)對新生小豬的左右心室的基因表達(dá)進(jìn)行比較，在得到的5600條帶中，有153條被識別的差異顯示條帶.Ponsuksili等［10］為了鑒定可能代表豬胴體性狀候選基因的ESTs，采用DD法對一個資源群體的F2代個體和純種的德國長白豬進(jìn)行研究，得到了6條差異表達(dá)的ESTs，其中的3條與已知基因無任何相似性，另3條與已知基因存在不同程度的相似性.本研究利用200對引物組合篩選到了在藍(lán)塘和大白豬種中存在明顯差異表達(dá)的5個肌肉組織的ESTs，其中ESTsp7與已知的線粒體基因組編碼的細(xì)胞色素c氧化酶亞單位Ⅲ基因高度相似.在線粒體編碼的3個大亞基中，亞基Ⅰ是一種完整的膜蛋白并帶有12個跨膜螺旋(Ⅰ～Ⅻ)，含有3個氧化還原反應(yīng)中心，并存在于所有的亞鐵血紅素－銅氧化酶中［11］.是否參與氧化呼吸鏈，影響肌肉的熟化代謝過程還有待深入研究.ESTsp9、ESTsp10、ESTsp11與豬SLN基因相似性達(dá)到了94% ～95%，表明是該基因的不同區(qū)段.SLN基因在骨骼肌肌漿網(wǎng)快肌纖維中有較高的表達(dá)，而在慢肌纖維中表達(dá)減少［12］.在心力衰竭的狗的心房中，檢測到SLN蛋白表達(dá)水平提高了3倍多，而在心肌缺血的心房中，表達(dá)水平減少30%.在受磷蛋白缺失的心房中，SLN蛋白表達(dá)量增加，在心房中SLN蛋白代償缺失了的受磷蛋白［13］.研究表明豬SLN基因在豬的背最長肌組織中表達(dá)最高，在大梅雜種豬中，背最長肌中該基因的表達(dá)量要高于梅山豬［14］.本研究發(fā)現(xiàn)，該基因上的ESTs片段在藍(lán)塘豬中表達(dá)均高于大白豬，能否作為一個影響中外豬種的產(chǎn)肉機(jī)制的候選基因，還需深入研究.

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