李小芳，馮小強(qiáng)，伏國慶，楊 聲，*，王廷璞，蘇中興

（1.天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅天水741001；2.天水市中醫(yī)醫(yī)院化驗(yàn)科，甘肅天水741001；3.蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，甘肅蘭州730000）

對氯苯氧乙酰改性殼聚糖的制備、抑菌及機(jī)理研究

李小芳1，馮小強(qiáng)1，伏國慶2，楊 聲1，*，王廷璞1，蘇中興3

（1.天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅天水741001；2.天水市中醫(yī)醫(yī)院化驗(yàn)科，甘肅天水741001；3.蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，甘肅蘭州730000）

采用紅外、紫外和熒光光譜對合成的對氯苯氧乙酰改性殼聚糖進(jìn)行了表征，研究了殼聚糖及對氯苯氧乙酰改性殼聚糖對六種常見細(xì)菌生長的影響。此外，考察了對氯苯氧乙酰改性殼聚糖對枯草芽孢桿菌細(xì)胞膜蛋白及其質(zhì)粒DNA的影響。結(jié)果表明：對氯苯氧乙酰改性殼聚糖對陰溝腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌性能比殼聚糖本身增強(qiáng)；對糞腸桿菌和肺炎克羅伯桿菌，起初抑制效果較好，但隨著作用時(shí)間的延長，卻失去了抑菌能力；對金黃色葡萄球菌作用24h后，才有微弱的抑菌活性；而對大腸桿菌幾乎沒有抑制作用。對氯苯氧乙酰改性殼聚糖對枯草芽孢桿菌的抑菌作用，可能是猝滅了其細(xì)胞膜蛋白的內(nèi)源熒光，而改變了膜蛋白的結(jié)構(gòu)，并且破壞質(zhì)粒DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)所引起的。

對氯苯氧乙酰殼聚糖，抑菌，機(jī)理

殼聚糖（簡稱CTS）能有效抑制細(xì)菌和真菌的生長［1-2］，與一般抑菌劑相比，殼聚糖具有抑菌活性高、廣譜、殺滅率高及對哺乳動物細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)［3］。殼聚糖只能溶解于酸性溶劑，這極大地限制了它的應(yīng)用范圍。苯氧乙酸及其衍生物是一種傳統(tǒng)的殺菌劑，又是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，已被廣泛用作農(nóng)業(yè)除草劑。將兩種具有生物活性的物質(zhì)鍵聯(lián)，期望得到的化合物能發(fā)揮兩者的獨(dú)特性能或協(xié)同效應(yīng)。本文合成了水溶性良好的對氯苯氧乙酰改性殼聚糖（CPOAC），研究了它對六種細(xì)菌生長的影響，并考察了對氯苯氧乙酰改性殼聚糖對枯草芽孢桿菌細(xì)胞膜蛋白及其質(zhì)粒DNA的影響，旨在探求一種水溶性和抑菌性能良好的抑菌劑。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

殼聚糖 分子量50000，DD95%，浙江玉環(huán)殼聚糖有限公司。

UV-2450紫外光譜儀 日本島津；Spectrum One傅立葉紅外光譜儀 Perkin Elmer。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備和表征 在 100mL燒瓶中依次加入0.01mol對氯苯氧乙酸、10.0mL甲苯和10.0mL新蒸的二氯亞砜，加熱攪拌回流1.5h，除去過量的二氯亞砜，得淡黃色透明清液為中間體對氯苯氧乙酰。向其中緩慢滴入含1.0g CTS的1%醋酸溶液25mL，控制在30min內(nèi)滴加完，在0～15℃內(nèi)繼續(xù)攪拌5h后，加入30g碎冰以終止反應(yīng)。酸混合液透析1d，除去多余的酸，而后用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至7.0，最后，將混合物再次透析3d，冷凍干燥，得到對氯苯氧乙酰改性殼聚糖。

采用KBr壓片，對CTS及CPOAC進(jìn)行紅外光譜測試；CTS溶解于1.0%（v/v）的HAc，CPOAC溶解于二次蒸餾水，測定紫外光譜；設(shè)定激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm，λex=320nm，測定熒光光譜。

1.2.2 CPOAC對微生物生長的影響 將活化后的受試菌種用接種環(huán)挑取置于生理鹽水中，制成OD610nm= 0.7的菌懸液備用。1mL的菌懸液接入含有4mL CTS或CPOAC的15mL液體培養(yǎng)基中，使CTS或CPOAC（溶于1.0%HAc）最終濃度為1mg/mL；以4mL 1.0% HAc溶液為空白對照，37℃下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24h，測定不同時(shí)間內(nèi)的OD610nm值。光密度越小，抑菌性能越強(qiáng)。

1.2.3 對細(xì)胞膜蛋白的影響 收獲枯草芽孢桿菌，用生理鹽水洗滌三次并重新懸浮，使菌懸液在610nm的吸收值為0.5。吸取1.0mL菌懸液和3.0mL CTS或CPOAC溶液混合，37℃下培養(yǎng)24h后，在300～450nm范圍內(nèi)掃描熒光光譜。設(shè)定激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為3nm，λex=280nm。

1.2.4 對質(zhì)粒DNA的影響 于10mL比色管中，分別加入4.0mL的Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液、2×10-5mol/L枯草芽孢桿菌質(zhì)粒 DNA溶液（A260/A280= 1.87）2.0mL和2.0mL 5mg/mL的CTS或CPOAC溶液，以二次蒸餾水定容，混合均勻后測定紫外吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 CTS及CPOAC的表征

2.1.1 紅外光譜 CTS及CPOAC的紅外光譜如圖1所示。CTS原位于3446cm-1左右的-OH與-NH的伸縮振動吸收締合峰，改性后峰形變窄；1664.51cm-1處較強(qiáng)的酰胺吸收峰，改性后位移至1640.98cm-1處，并且在1774.27cm-1處也有一吸收峰，歸屬為酸酐中-C=O的伸縮振動吸收峰，證明產(chǎn)物中既有酰胺，也有酸酐；1600.13cm-1左右的吸收峰為CTS中-NH2面內(nèi)彎曲振動，改性后移動到 1616.94cm-1；位于1152.84cm-1處仲羥基的C-O伸縮振動吸收峰，發(fā)生改性后移動到1156.58cm-1，位于1084.18cm-1處的伯羥基的C-O伸縮振動吸收峰消失。說明CTS中的-OH與-NH2都參與了反應(yīng)。另外，CPOAC在1492.64cm-1有一弱吸收峰，歸屬為芳環(huán)C-C骨架的伸縮振動，879.95cm-1的弱吸收峰歸屬為苯環(huán)中= C-H的彎曲振動吸收峰。

圖1 CTS及CPOAC紅外光譜

2.1.2 紫外光譜 殼聚糖的醋酸溶液在200nm處有紫外吸收，將對氯苯氧乙酰接枝到殼聚糖分子上形成酰胺或酸酐鍵后，由于酰胺、碳氧雙鍵、苯環(huán)等生色團(tuán)的影響，對氯苯氧乙酰改性殼聚糖紫外吸收與殼聚糖本身相比，200nm的峰發(fā)生明顯的藍(lán)移，并在250nm左右有微弱吸收。

圖2 CTS和CPOAC的紫外光譜

2.1.3 熒光光譜 CTS自身熒光強(qiáng)度很弱，在激發(fā)光源的作用下，在362nm和640nm產(chǎn)生兩個(gè)發(fā)射峰，其熒光強(qiáng)度分別為152和205。對氯苯氧乙酰接枝到CTS分子上后，在421nm和642nm產(chǎn)生兩個(gè)發(fā)射峰，熒光強(qiáng)度分別為798和381，較CTS大大增強(qiáng)。是由于CPOAC中引入了酰胺、碳氧雙鍵、苯環(huán)，增大了分子內(nèi)的電荷密度，降低了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移態(tài)的能量，發(fā)光量子產(chǎn)率增大，則會使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

圖3 CTS和CPOAC的熒光光譜

2.2 CTS及CPOAC的抑菌性能

CTS及CPOAC的抑菌活性如圖4所示。CTS作用陰溝腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸桿菌、肺炎克羅伯桿菌和大腸桿菌一定時(shí)間后，對應(yīng)的光密度值均小于對照組，表明CTS具有較好的抑菌性能，且隨著時(shí)間的延長這種趨勢比較穩(wěn)定。與CTS相比，對氯苯氧乙酰改性殼聚糖對陰溝腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌性能比殼聚糖本身增強(qiáng)；對糞腸桿菌和肺炎克羅伯桿菌的抑制作用，起初抑制效果較好，但隨著作用時(shí)間的延長，失去了抑菌能力；對金黃色葡萄球菌作用24h后，才有微弱的抑菌活性；而對大腸桿菌幾乎沒有抑制作用。

圖4 CTS和CPOAC抑菌作用

2.3 CTS及CPOAC對細(xì)胞膜蛋白的影響

蛋白質(zhì)分子中因含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸殘基而產(chǎn)生內(nèi)源性熒光。在大多數(shù)情況下，可以認(rèn)為蛋白質(zhì)所顯示的熒光主要來自色氨酸殘基的貢獻(xiàn)，而且含色氨酸殘基的蛋白質(zhì)的天然熒光及其變化直接反映了蛋白質(zhì)中色氨酸殘基本身及其周圍環(huán)境的變化。向枯草芽孢桿菌菌懸液中加入殼聚糖或CPOAC溶液，結(jié)果如圖5所示：在激發(fā)波長為280nm時(shí)，菌懸液的最大發(fā)射波長在339nm；而殼聚糖在λem=339nm無熒光產(chǎn)生。隨著殼聚糖加入，菌懸液內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低，熒光的最大發(fā)射波長藍(lán)移，表明色氨酸疏水性增強(qiáng)［4］；加入CPOAC后，菌懸液內(nèi)源熒光強(qiáng)度也降低，且較加入CTS后熒光強(qiáng)度降低的更多，發(fā)射峰位的位置和峰形變化不大，這說明CTS和CPOAC對枯草芽孢桿菌細(xì)胞膜蛋白的熒光都具有猝滅作用，且CPOAC的熒光猝滅作用更強(qiáng)，進(jìn)而改變了細(xì)胞膜蛋白的結(jié)構(gòu)，這與抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)論相一致。

圖5 CTS和CPOAC對膜蛋白熒光的影響

2.4 CTS及CPOAC對質(zhì)粒DNA的影響

由于核酸分子本身有光吸收活性，許多外來分子與核酸結(jié)合后，對核酸或外來分子的吸收都有影響。含有堿基生色團(tuán)雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA分子，其UV-vis吸收光譜在260nm附近有一強(qiáng)的吸收峰，某些小分子亦有吸收譜帶，可根據(jù)相互作用前后DNA或其他分子的吸收譜帶的變化對二者相互作用模式進(jìn)行判斷。對DNA的吸收光譜來說，如果導(dǎo)致分子的軸向變化即其構(gòu)象變化，則產(chǎn)生減色效應(yīng)及紅移現(xiàn)象，且作用越強(qiáng)，減色效應(yīng)越明顯；如果導(dǎo)致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的破壞，則產(chǎn)生增色效應(yīng)［5］。

DNA在 260nm處有一強(qiáng)吸收峰，而 CTS和CPOAC在260nm附近沒有紫外吸收。隨著DNA溶液中加入相同濃度的CTS或CPOAC，其吸收光譜發(fā)生了明顯的增色效應(yīng)，并且加入CPOAC后紫外吸收峰強(qiáng)度強(qiáng)于加入殼聚糖，如圖6所示，表明CTS和CPOAC均與DNA之間發(fā)生相互作用而形成了新的復(fù)合物，導(dǎo)致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞，且CPOAC的破壞作用比CTS更強(qiáng)，這與抑菌實(shí)驗(yàn)和熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)論相一致。

圖6 加入CTS或CPOAC后DNA溶液的紫外光譜

3 結(jié)論

3.1 對氯苯氧乙酰改性殼聚糖對陰溝腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌性能比殼聚糖本身增強(qiáng)；對糞腸桿菌和肺炎克羅伯桿菌的抑制作用，起初抑制效果較好，但隨著作用時(shí)間的延長，失去了抑菌能力；對金黃色葡萄球菌作用24h后，才有微弱的抑菌活性；而對大腸桿菌幾乎沒有抑制作用。

3.2 對氯苯氧乙酰改性殼聚糖對肺炎克羅伯桿菌的抑菌作用是通過猝滅細(xì)胞膜蛋白，改變了膜蛋白的結(jié)構(gòu)，并且破壞DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)而引起的。

［1］Xiao-fang Li，Xiao-qiang Feng，Sheng Yang，et al.Effects of Molecular Weight and Concentration of Chitosan on Antifungal Activity Against Aspergillus Niger［J］.Iranian Polymer Journal，2008，17（11）：843-852.

［2］Chung YC，Chen CY.Antibacterial characteristic chitosan and activity of acid-soluble chitosan［J］.Bioresource Technology，2008，99：2806-2814.

［3］Chun-Ho Kim，So-Yeou Kim，Kyu-Suk Choi.Synthesis and Antibacterial Activity of Water-soluble Chitin Derivatives［J］. Polymers of Advanced Technologies，1997（8）：319-325.

［4］Hu Y J，Liu Y，Zhao R M，et al.Interaction of colchicine with human serum albumin investigated by spectroscopic methods［J］. Int J Biol Macromol，2005，37：122.

［5］杜江燕，黃曉華，徐飛，等.硫堇與DNA分子作用機(jī)理的光譜研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2005，25（9）：1435.

Synthesis，antibacterial activity and mechanism of para chlorinepenoxyacetyl chitosan

LI Xiao-fang1，F(xiàn)ENG Xiao-qiang1，F(xiàn)U Guo-qing2，YANG Sheng1，*，WANG Ting-pu1，SU Zhong-xing3
（1.College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，China；2.Traditional Medical Hospital of Tianshui，Tianshui 741001，China；3.College of Chemistry and Chemical Engineering，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

Para Chlorinepenoxyacetyl chitosan（CPOAC）was prepared and characterized by lR，UV spectra and fluorescence spectra.Antibacterial activity of CPOAC was evaluated against six species of bacteria in vitro. Moreover，the effect of CPOAC on cell membrane protein and plasmid DNA were investigated to illustrate the antibacterial mechanism.The results showed that the antibacterial activity of CPOAC against E.cloacae，B.subtilis was better than chitosan.The antibacterial activity was better than chitosan at first against E.faecalis and S.pneumoniae，but lost the antibacterial activity with the prolong of time.There was low antibacterial activity against S.aureus for 24h later，while CPOAC showed no antibacterial activity against E.coli.The antibacterial activity of CPOAC against B.subtilis was resulted by quenching the fluorescence intensity of cell membrane protein，altering the structure of cell membrane protein and damaging the two-helical structure of plasmid DNA.

para chlorinepenoxyacetyl chitosan；antibacterial activity；mechanism

TS201.1

A

1002-0306（2011）02-0133-03

2010-02-26 *通訊聯(lián)系人

李小芳（1983-），女，碩士研究生，研究方向：天然高分子。

甘肅天水師范學(xué)院物理無機(jī)化學(xué)重點(diǎn)學(xué)科基金。