孫敏杰，木泰華

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)研究室，北京100193）

蛋白質(zhì)消化率測(cè)定方法的研究進(jìn)展

孫敏杰，木泰華*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)研究室，北京100193）

對(duì)蛋白質(zhì)消化率進(jìn)行研究，不僅能使人們了解蛋白質(zhì)的消化特性，而且對(duì)于研究蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要的意義。為此，對(duì)國(guó)內(nèi)外食品中蛋白質(zhì)消化率測(cè)定的常用方法進(jìn)行了綜述與評(píng)價(jià)，并對(duì)各種蛋白質(zhì)消化率測(cè)定方法的優(yōu)缺點(diǎn)及適用的范圍進(jìn)行了討論。

蛋白質(zhì)，消化率，體內(nèi)，體外

評(píng)價(jià)食物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的一個(gè)重要指標(biāo)就是蛋白質(zhì)的質(zhì)量。所謂“質(zhì)”是考察食物蛋白質(zhì)必需氨基酸的含量、模式以及機(jī)體對(duì)其消化、利用的程度，而“量”則是考察食物中蛋白質(zhì)含量的多少［1］。在以往對(duì)蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行研究時(shí)，主要以蛋白質(zhì)含量和必需氨基酸模式為主，常常忽略對(duì)其消化和吸收利用程度的研究。然而，某些蛋白質(zhì)，即便其氨基酸組成符合FAO/WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)，但由于受到蛋白質(zhì)來(lái)源（動(dòng)物、植物）、非蛋白成分（膳食纖維、胰蛋白酶抑制劑）及生理等因素的影響，這些蛋白質(zhì)在體內(nèi)消化、吸收和利用的程度可能會(huì)很低，從而導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)價(jià)值偏低。蛋白質(zhì)消化率是指人體從蛋白質(zhì)中吸收的氮占攝入氮的比值，反映了食物蛋白質(zhì)被消化酶分解、吸收的程度［1］。目前測(cè)定食品蛋白質(zhì)消化率主要包括體外蛋白質(zhì)消化率和體內(nèi)蛋白質(zhì)消化率兩種方法。因此，在對(duì)蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)該對(duì)其消化率進(jìn)行測(cè)定和分析，這對(duì)全面評(píng)價(jià)食物營(yíng)養(yǎng)具有重要的意義。

1 蛋白質(zhì)消化率測(cè)定方法

1.1 體外蛋白質(zhì)消化率測(cè)定法

體外消化率測(cè)定法是模擬蛋白質(zhì)在人體內(nèi)消化過(guò)程的一種方法，該法不僅可以直接預(yù)測(cè)食物蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還可以提供各種蛋白質(zhì)在胃、腸內(nèi)消化和吸收的情況。這種方法不需要活體動(dòng)物，而且與體內(nèi)消化率測(cè)定法有著很高的相關(guān)性，可以人為準(zhǔn)確地控制實(shí)驗(yàn)條件，不同實(shí)驗(yàn)室間測(cè)定的結(jié)果可比性好，測(cè)定效率和穩(wěn)定性高，成本低。體外蛋白質(zhì)消化率測(cè)定法主要包括兩個(gè)步驟，一是先利用蛋白酶水解蛋白質(zhì)，然后再通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)的水解度來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)的消化率或采用其它方法對(duì)蛋白質(zhì)的消化程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖1為蛋白質(zhì)體外消化率測(cè)定法的一般步驟。

圖1 蛋白質(zhì)體外消化率測(cè)定法的一般步驟

1.1.1 蛋白質(zhì)的酶解過(guò)程 體外消化率測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)消化率的第一步就是使用蛋白酶水解蛋白質(zhì)來(lái)模擬食物在人體內(nèi)的消化過(guò)程，主要包括胃蛋白酶一步消化法、多酶一步消化法、人體活性胃液和十二指腸汁液一步消化法及胃蛋白酶和胰蛋白酶分步消化法等。胃蛋白酶一步消化法［2-5］采用胃蛋白酶直接進(jìn)行水解，用酶單一，操作簡(jiǎn)單，但由于單一酶不能將某一蛋白質(zhì)水解成所有可利用的氨基酸，所以此方法測(cè)得的消化率偏低；多酶一步消化法多采用的是胰蛋白酶、糜蛋白酶和肽酶的混合物直接進(jìn)行水解［6-11］，操作簡(jiǎn)便，此混合酶具有協(xié)同作用，可將蛋白質(zhì)充分水解，測(cè)得的消化率較高［12］；人體活性胃液和十二指腸汁液一步消化法［13-14］是使用三腔管收集人體活性胃液和十二指腸汁液，可直接對(duì)所測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行消化，此方法可以很好地模擬人體對(duì)蛋白質(zhì)的消化，但是采用該法收集消化液的難度較大，胃液和十二指腸液中蛋白酶的種類和活力還會(huì)因受試者的年齡、胃腸消化功能等因素存在差異，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性差；胃蛋白酶和胰蛋白酶分步消化法在體外消化模型研究中應(yīng)用較廣，其原理是首先用胃蛋白酶在酸性條件模擬食物在胃內(nèi)的消化過(guò)程，用堿將胃蛋白酶活力鈍化后，再模擬營(yíng)養(yǎng)成分在小腸的消化過(guò)程，用胰蛋白酶在中性條件下繼續(xù)消化，最后將已消化的營(yíng)養(yǎng)成分與未消化的營(yíng)養(yǎng)成分分開后并分別進(jìn)行測(cè)定［15-17］。該法能夠很好地模擬食物在消化道內(nèi)的消化過(guò)程，從而可以很好地反映食物蛋白在不同消化階段被消化的情況。此外，與人體胃液及腸液相比，胃蛋白酶及胰蛋白酶比較容易獲得，而且各種酶的組分也較易分析，測(cè)定的結(jié)果重現(xiàn)性好。

1.1.2 蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物分析及消化率計(jì)算的方法

1.1.2.1 pH降低法 pH降低法是通過(guò)測(cè)定一定消化時(shí)間后的pH降低值來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)消化率的方法。一般使用胰蛋白酶、糜蛋白酶和肽酶的混合物對(duì)蛋白樣品進(jìn)行消化。其原理是在蛋白酶消化樣品的過(guò)程中，樣品蛋白肽鍵斷裂，釋放出氫離子，導(dǎo)致懸濁液的pH降低，在起始后第10min，該法與體內(nèi)大鼠糞氮平衡實(shí)驗(yàn)所測(cè)消化率的結(jié)果具有較高相關(guān)性（r＞0.80）［6，18］。

pH降低法體外消化率的計(jì)算公式如下［7］：

式中：Y-體外消化率（%）；X-添加多酶溶液（胰蛋白酶、糜蛋白酶和肽酶的混合物）的樣品消化第10min所測(cè)pH。

1.1.2.2 pH恒定法 pH恒定法是通過(guò)測(cè)定一定消化時(shí)間后pH降低所產(chǎn)生氫離子的濃度從而計(jì)算出蛋白質(zhì)消化率的方法。即在使用胰蛋白酶、糜蛋白酶、肽酶混合液對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行消化過(guò)程中，采用恒pH自動(dòng)滴定儀，向消化液中不斷地滴入0.1mol/L NaOH溶液與蛋白質(zhì)水解過(guò)程中產(chǎn)生的氫離子作用，并使樣品消化液pH保持或恒定在8.0，再根據(jù)水解第10min時(shí)所添加的堿量來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)消化率［19］。此外，與pH降低法相比，pH恒定法與體內(nèi)消化法動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果具有高度的相關(guān)性（r=0.96）。pH恒定法體外消化率的計(jì)算公式如下［12，17-18］：

式中：TD-蛋白質(zhì)消化率（%）；B10-水解第10min所添加NaOH溶液的量（mL）。

1.1.2.3 TCA沉淀法 即先使用胃蛋白酶和胰蛋白酶分步對(duì)蛋白樣品進(jìn)行消化，然后向消化液中加入TCA溶液，離心將未消化的蛋白質(zhì)沉淀后測(cè)定其蛋白質(zhì)含量，最后計(jì)算蛋白質(zhì)消化率的方法。TCA沉淀法可精確定量未/已消化蛋白，但是結(jié)果要比pH恒定法低［12］。TCA沉淀法體外消化率的計(jì)算公式如下［12，21-25］：

現(xiàn)代人力資本理論的先驅(qū)西奧多·舒爾茨指出：“人的知識(shí)、能力、健康等人力資本的提高對(duì)經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)的貢獻(xiàn)比物力、勞動(dòng)力數(shù)量的增加要重要得多，在改變窮人的福利中，決定性的生產(chǎn)要素不是空間、能源和耕地，而是人的質(zhì)量的改進(jìn)?！?/p>

式中：N0-消化前蛋白質(zhì)樣品中TCA沉淀物中的氮含量（mg）；Nt-消化后的TCA沉淀物中的氮含量（mg）；Ntot-蛋白質(zhì)樣品中的總氮含量（mg）。

1.1.2.4 SDS-PAGE法 SDS-PAGE法一般是對(duì)體內(nèi)外蛋白消化產(chǎn)物進(jìn)行定性分析的一種方法。該法可對(duì)不同消化時(shí)間及不同蛋白水解產(chǎn)物的分子量進(jìn)行推定，并可通過(guò)電泳條帶的變化直觀地分析和判斷蛋白消化難易的程度［14-15，26-27］。SDS-PAGE法可較為準(zhǔn)確地分析水解產(chǎn)物的分子量的變化，但操作較為復(fù)雜、時(shí)間較長(zhǎng)。此外，在分析轉(zhuǎn)基因外源蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，還可通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)在不同消化時(shí)間的水解產(chǎn)物進(jìn)行電泳和印跡，從而確定某一蛋白質(zhì)在模擬人體胃/腸消化過(guò)程中被完全消化的時(shí)間，推斷該外源蛋白在模擬人體胃/腸消化過(guò)程中的穩(wěn)定性［28］。

1.1.2.5 RP-HPLC法 RP-HPLC法是對(duì)體內(nèi)外蛋白消化產(chǎn)物進(jìn)行定性、定量分析并能回收各種水解肽的一種方法。該法不僅可對(duì)不同消化時(shí)間及不同蛋白水解產(chǎn)物的組成及含量進(jìn)行分析，而且還能針對(duì)目標(biāo)肽進(jìn)行純化和收集［29］。但此法分析設(shè)備較貴，樣品需要進(jìn)行前處理。將水解后生成肽的總峰面積與水解后肽-蛋白質(zhì)的總峰面積相比，得出蛋白質(zhì)的消化率［30］：

1.2 體內(nèi)蛋白質(zhì)消化率測(cè)定法

體內(nèi)蛋白質(zhì)消化率測(cè)定法是通過(guò)動(dòng)物體研究和分析蛋白質(zhì)的消化率、評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)質(zhì)量的方法［1］。其中，采用大鼠糞氮平衡實(shí)驗(yàn)是最適合預(yù)測(cè)人體消化率的一種較權(quán)威的方法［19］。其原理是待測(cè)蛋白質(zhì)（攝入氮）在被吸收前，首先在胃酸作用下，胃中的胃蛋白酶原轉(zhuǎn)換成胃蛋白酶對(duì)食物蛋白質(zhì)進(jìn)行消化，接著是被腸中的胰蛋白酶和糜蛋白酶作用，最后，少量的來(lái)自微生物細(xì)胞和脫落的腸內(nèi)粘膜細(xì)胞的糞代謝氮及不能被消化的食物蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)結(jié)腸時(shí)，一起從糞便中排出（糞氮）［31］。如果不計(jì)糞代謝氮，攝入氮與糞氮的差值占攝入氮的比例稱為表觀消化率。由于表觀消化率的測(cè)定方法簡(jiǎn)單易行，所以應(yīng)用較廣。但是表觀消化率所測(cè)得的結(jié)果與實(shí)際值相比較低。因此，需要對(duì)無(wú)蛋白飼料條件下所產(chǎn)生的糞代謝氮進(jìn)行測(cè)定來(lái)校正表觀消化率。然而，由于無(wú)蛋白飼料會(huì)引起動(dòng)物機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以現(xiàn)多采用向飼料中添加5%具有高消化性酪蛋白后再測(cè)定糞代謝氮的方法［32］。這種含糞代謝氮的消化率計(jì)算方法被稱為蛋白質(zhì)的真消化率［33-34］。其計(jì)算公式如下：

蛋白質(zhì)真消化率（%）=氮吸收量/攝入氮=［攝入氮-（糞氮-糞代謝氮）］/攝入氮×100% 式（5）

大鼠糞氮平衡實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是對(duì)糞便的精確收集，通常使用傳統(tǒng)大鼠飼養(yǎng)籠不能嚴(yán)格分離動(dòng)物的糞便及尿液［32］。因此，目前已有新型的大鼠代謝籠問(wèn)世，可以很好地將大鼠糞便與尿液進(jìn)行分離。

2 討論

蛋白質(zhì)體內(nèi)消化率測(cè)定法與體外消化率測(cè)定法各有利弊。1991年在意大利羅馬舉辦的FAO/WHO蛋白質(zhì)質(zhì)量評(píng)價(jià)專家咨詢會(huì)指出，蛋白質(zhì)體內(nèi)消化率、體外消化率與人體臨床研究測(cè)定的方法得到的數(shù)據(jù)具有很好的相關(guān)性［35］。體內(nèi)法測(cè)定的消化率能夠比較真實(shí)地反映動(dòng)物對(duì)食物的消化情況，但體內(nèi)消化率測(cè)定法操作復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用高，且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)外界環(huán)境的要求較高，季節(jié)、溫度、光照等都會(huì)影響消化率的測(cè)定值。因此，體內(nèi)消化率測(cè)定法可以作為一種驗(yàn)證的方法，但不適合做大規(guī)模食品評(píng)定。相比而言，體外消化法是利用精制的消化酶或生物體消化道酶提取液在試管內(nèi)進(jìn)行的消化實(shí)驗(yàn)，其測(cè)定值可較為準(zhǔn)確地反映動(dòng)物對(duì)食物的消化率［36］。該方法簡(jiǎn)便且重復(fù)性好，不僅適用于大規(guī)模食品評(píng)定，更適用于蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量的分級(jí)和對(duì)蛋白質(zhì)體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的預(yù)測(cè)，并能檢測(cè)出同種物料的不同樣品間質(zhì)量的微小差異。

然而，還存在影響體外消化率測(cè)定結(jié)果的各種因素，如被測(cè)食物的粒徑及組成成分、蛋白酶的數(shù)量及種類、消化條件、蛋白質(zhì)水解物的分析方法等。因此，用一個(gè)單純的體外消化模型來(lái)再現(xiàn)所有復(fù)雜的生化和生理過(guò)程是不可能的［6］。此外，體外和體內(nèi)消化率測(cè)定法結(jié)果間還存在一定的差異，所以在選用體外消化率測(cè)定法對(duì)具體食物蛋白消化率進(jìn)行測(cè)定和分析時(shí)，盡可能比較兩種方法間的相關(guān)性［37］。相關(guān)系數(shù)越高，表明體外消化率測(cè)定法可信度就越高。因此，為了更科學(xué)地模擬人體消化，體外消化率測(cè)定法還需要進(jìn)一步完善和發(fā)展。

3 結(jié)論

體外蛋白質(zhì)消化率測(cè)定法和體內(nèi)消化率測(cè)定法都是預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)在人體中消化率較常用的方法。在體外蛋白質(zhì)消化率測(cè)定法中，pH降低法與pH恒定法操作簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好，特別是pH恒定法與體內(nèi)法所測(cè)結(jié)果相關(guān)性最高；TCA沉淀法可精確定量未/已消化蛋白含量，但測(cè)定值偏低；SDS-PAGE法與RP-HPLC法可對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，但需前處理，且測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)；在體內(nèi)蛋白質(zhì)消化率測(cè)定法中，蛋白質(zhì)的真消化率最為準(zhǔn)確。

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Development of methods for the determination of protein digestibility

SUN Min-jie，MU Tai-hua*
（Laboratory of Food Chemistry and Nutrition Science，Institute of Agro-Food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）

The study of protein digestibility，not only makes people aware of the characteristic of protein digestion，but also is of great significance to study the nutritional value of protein and its application.Therefore，commonly used methods for the determination of protein digestibility of foods at home and abroad were reviewed and evaluated.ln addition，the advantages and disadvantages，and the scope of application of different methods for the determination were also discussed.

protein；digestibility；in vivo；in vitro

TS201.2+1

A

1002-0306（2011）02-0382-04

2010-01-15 *通訊聯(lián)系人

孫敏杰（1982-），女，在讀博士研究生，研究方向：食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)。

國(guó)家“863”計(jì)劃資助項(xiàng)目（2006AA10Z332）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助。