李東紅，刁俊林，劉建倉(cāng)，胥 婷

(創(chuàng)傷、燒傷、復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第三軍醫(yī)大學(xué) 大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第二研究室，重慶 400042)

為提高敷料的抗菌性能，人們進(jìn)行了大量的嘗試，研究發(fā)現(xiàn)銀原子具有一定的殺菌能力，尤其是當(dāng)被制成納米級(jí)的顆粒后，由于其比表面積大幅提高，表面原子所占比例增大，其殺菌活性也相應(yīng)提高［1-4］。由于納米銀的這些特點(diǎn)，納米銀敷料的研制受到人們的關(guān)注。如姜會(huì)慶等［5］將納米銀材料種植附著在棉紗纖維上制得一種納米銀敷料，用于治療燒傷創(chuàng)面及久治不愈的褥瘡收到了良好效果。本文報(bào)道了一種載納米銀生物海綿的制備方法及其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑制能力，為其作為新型抗菌生物敷料用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

殼聚糖(臺(tái)州康多海洋生物醫(yī)藥化工有限公司);海藻酸鈉、戊二醛、硝酸銀(國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司);膠原蛋白(北京嘉康源化學(xué)試劑有限公司);可吸收性明膠海綿(南京金陵制藥廠);水解酪蛋白瓊脂板(溫州市康泰生物科技有限公司)。

金黃色葡萄球菌(ATCC25922)、大腸埃希菌(ATCC25923)和銅綠假單胞菌(ATCC27853)均由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

SD大鼠，STF級(jí)，雌雄不拘，體重200～225 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(渝)2007-0005。

2 方法

2.1 生物海綿及納米銀生物海綿的制備

將一定比例的殼聚糖、海藻酸鈉和膠原蛋白混合膠液用戊二醛交聯(lián)，冷凍干燥后得生物海綿;將一定量的硝酸銀溶液加入一定比例的殼聚糖、海藻酸鈉和膠原蛋白的混合膠液中，戊二醛交聯(lián)，冷凍干燥，100℃烘烤4 h，紫外線照射2 h后形成納米銀生物海綿。

2.2 納米銀粒徑的測(cè)定

樣品表面鍍金后，用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(FEI NOVA nano SEM 400)對(duì)該納米銀生物海綿表面納米銀的粒徑進(jìn)行分析(加速電壓:10 kV;工作距離:5.0 mm)。

2.3 體外抑菌效果的測(cè)定

將生物海綿、納米銀生物海綿和可吸收性明膠海綿搟壓成薄片，裁剪成直徑為6 mm的圓片，紫外線照射殺菌。將細(xì)菌配制成1.5×108個(gè)/mL的菌液，用滅菌后的棉拭子蘸取菌液，反復(fù)、均勻地涂布于整個(gè)水解酪蛋白瓊脂板上，用鑷子取海綿平貼在平板表面，37℃孵箱中培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)尺測(cè)量抑菌圈大小。

2.4 在體抑菌效果的測(cè)定

將30只SD大鼠背部作為致傷部位，傷前1 d用8%Na2S去毛。3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，將大鼠俯臥固定于手術(shù)臺(tái)上，背部用碘酒和75%酒精消毒，于正中剪去大約1.5cm×1.5 cm的皮膚(深至肉膜)制成受傷創(chuàng)面，用無菌棉拭子擦去血液后，在創(chuàng)面涂抹金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌的混合菌液(混合前，各菌液均為1.0麥?zhǔn)蠞舛?，然后在創(chuàng)面上覆蓋受試海綿，再以無菌脫脂紗布覆蓋海綿，包扎固定。隨機(jī)分成兩個(gè)組，可吸收性明膠海綿組和納米銀生物海綿組，每組各15只大鼠，分別于致傷后1，2，3，7和14 d開啟敷料(中途如有敷料脫落，及時(shí)更換)，觀察創(chuàng)面的大體情況，少量生理鹽水沖洗創(chuàng)面后，用無菌棉拭子擦刮痂下組織滲液，作細(xì)菌培養(yǎng)，鑒定細(xì)菌的種屬和數(shù)量。

3 結(jié)果

3.1 海綿中納米銀的粒徑

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在生物海綿表面彌散分布有納米銀顆粒，呈球形，顆粒尺寸大小不一，分布范圍為20～80 nm，但大約85%的納米銀顆粒的粒徑為40 nm，結(jié)果見圖1。

圖1 載納米銀生物海綿SEM圖Fig.1 SEM of bio-sponge loading Ag nanoparticle

3.2 體外抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖2所示，可吸收性明膠海綿和生物海綿對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌三個(gè)菌種都沒有產(chǎn)生抑菌圈，而納米銀生物海綿對(duì)三個(gè)菌種都有一定的抑制作用，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌能力稍弱一點(diǎn)，可產(chǎn)生10～11 mm的抑菌圈(包括海綿的直徑)，而對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用明顯，可產(chǎn)生13～14 mm的抑菌圈。且納米銀生物海綿抑菌能力與納米銀的含量有一定關(guān)系，當(dāng)硝酸銀含量小于3.8%，抑菌效果不明顯(照片未顯示)，但當(dāng)硝酸銀的含量大于7.6%后再增加硝酸銀的含量并不能明顯增強(qiáng)其抑菌能力。

圖2 體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of anti-bacteria in vitro

3.3 傷口的大體觀察及細(xì)菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果

明膠海綿組在細(xì)菌感染后的前3 d，大鼠背部傷口有明顯膿斑，1周后傷口痂下可見明顯新生肉芽組織，但傷口仍有小量膿斑，2周后大鼠傷口愈合良好，痂面縮小到原傷口的1/2～1/3;載納米銀海綿組在細(xì)菌感染后的第3天，大鼠背部也可見膿斑，但較明膠海綿組少，1周后傷口痂下可見明顯新生肉芽組織，已無膿斑，2周后大鼠傷口愈合良好，痂面縮小到原傷口的1/2～1/3，與明膠海綿組比較無明顯差別。細(xì)菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果見表1。在感染后的第1天，明膠海綿組檢測(cè)到大量的銅綠假單胞菌和中量的金黃色葡萄球菌，而載納米銀海綿組只檢測(cè)到少量的銅綠假單胞菌和中量的金黃色葡萄球菌;在隨后各時(shí)間點(diǎn)，明膠海綿組檢測(cè)到的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均明顯多于載納米銀海綿組，到第2周，載納米銀海綿組已基本檢測(cè)不到細(xì)菌，但明膠海綿組仍可以檢測(cè)到少量細(xì)菌。但兩組在各時(shí)相點(diǎn)均沒有檢測(cè)到大腸桿菌。

表1 海綿的在體抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of anti-bacteria of sponge in vivo

4 討論

在因創(chuàng)傷、擦傷、燒傷及潰爛等而導(dǎo)致皮膚傷害后，很容易造成細(xì)菌感染、體液流失并引起各種并發(fā)癥。因此，創(chuàng)面感染一直是平戰(zhàn)時(shí)創(chuàng)傷、燒傷等治療中面臨的重要課題［6］。在治療這種有組織損失的人體皮膚損傷時(shí)，通常采用敷料對(duì)傷口進(jìn)行保護(hù)，防止傷口的感染和脫水，在傷口處維持有利于治療的潮濕環(huán)境，改善治療效果，促進(jìn)傷口愈合。理想敷料應(yīng)具備如下特征［7］:(1)安全無毒，無刺激性;(2)良好的生物相容性和可降解性;(3)可保持創(chuàng)面的濕潤(rùn)環(huán)境，具較好的吸收能力和一定的透氣性;(4)阻止細(xì)菌侵入，抑制細(xì)菌生長(zhǎng);(5)最好有止血、止痛等作用，可促進(jìn)肉芽生長(zhǎng)和皮膚再生，加速愈合，減少疤痕;(6)貯存穩(wěn)定性好。目前還沒有敷料能完全達(dá)到這些要求。

現(xiàn)臨床上使用最多的敷料還是紗布。這種惰性敷料，雖然具有吸收性好、保護(hù)創(chuàng)面、制作簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，但由于其無法保持創(chuàng)面濕潤(rùn)、易與傷口粘連、不能阻止細(xì)菌入侵等缺點(diǎn)，因而對(duì)傷口的感染和化膿無能為力，對(duì)創(chuàng)面的愈合無明顯促進(jìn)作用，在換藥時(shí)還會(huì)造成對(duì)新生組織的再次損傷，增加病人的痛苦。為了克服傳統(tǒng)紗布敷料的不足，許多生物敷料如可吸收性明膠海綿、膠原蛋白海綿等應(yīng)運(yùn)而生。這些生物載藥敷料由于其獨(dú)特的性能，如良好的組織相容性和可降解性、安全低毒、在保護(hù)創(chuàng)面的同時(shí)還能有效地治療傷口，促進(jìn)組織修復(fù)等而倍受人們的關(guān)注。

為了改善敷料的性能，人們通過在敷料中載入不同的抗生素［8-9］、單質(zhì)碘［10］等來提升敷料的抑菌能力，但由于許多菌種對(duì)抗生素產(chǎn)生了耐藥性，而碘不穩(wěn)定，易升華，使這類敷料的應(yīng)用受到限制。單質(zhì)銀具有廣譜殺菌能力，特別是在制備成納米級(jí)的顆粒后。且銀的殺菌機(jī)制不同于化學(xué)合成的抗菌劑，主要是基于重金屬離子對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)的變性作用，因而具有廣譜殺菌及很少產(chǎn)生耐藥菌的特點(diǎn)［11］。

納米銀的制備方法有多種，本文采用簡(jiǎn)單實(shí)用的射線輻照法［12］，通過紫外線照射含硝酸銀的生物海綿得到了載有納米銀的生物海綿。經(jīng)SEM測(cè)試，證實(shí)銀顆粒的粒徑主要為40 nm。

在體外抑菌試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，納米銀生物海綿對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌都有一定的抑制作用，尤其是對(duì)銅綠假單胞菌，而可吸收性明膠海綿和未載納米銀生物海綿對(duì)三個(gè)菌種都沒有產(chǎn)生抑菌圈。殼聚糖的抑菌作用已有文獻(xiàn)報(bào)道［13-15］，生物海綿中的主要成分為殼聚糖，沒有觀察到生物海綿的抑菌作用可能與殼聚糖的抑菌機(jī)理有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道的殼聚糖抑菌研究都是在液態(tài)中測(cè)定的，在酸性條件下，殼聚糖分子中的質(zhì)子化銨具有正電性，可吸附帶有負(fù)電荷的細(xì)菌，使細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上的負(fù)電荷分布不均，干擾細(xì)胞壁的合成，破壞細(xì)胞膜的功能，使細(xì)胞膜因不能承受滲透壓而變形破裂，發(fā)生細(xì)菌溶解而亡［16］。但在我們的試驗(yàn)條件，生物海綿中的殼聚糖處于中性的固體狀態(tài)，因而很難實(shí)現(xiàn)它的抑菌作用。另外，在交聯(lián)過程中，殼聚糖分子中的氨基很可能與戊二醛發(fā)生反應(yīng)，而殼聚糖分子中氨基上的反應(yīng)也會(huì)改變殼聚糖的抑菌性能［17］。由此可見，載納米銀生物海綿產(chǎn)生的抑菌作用應(yīng)歸功于海綿表面上的納米銀顆粒。

在體抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步印證了載納米銀海綿對(duì)細(xì)菌，尤其是銅綠假單胞菌的抑制能力。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，在各時(shí)相點(diǎn)，兩組均沒有檢測(cè)到大腸桿菌。據(jù)報(bào)道［18-20］，某些銅綠假單胞菌菌株能夠產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，對(duì)其他菌種的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制和滅殺作用，因此，我們認(rèn)為沒有檢測(cè)到大腸桿菌可能歸因于銅綠假單胞菌對(duì)大腸桿菌的滅殺作用。

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