陳 博，沈燕慧，盧 偉，朱 浩，孫麗娟，唐楊順，趙 云，田 風(fēng)，金 鑫

(廈門大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361005)

油酰乙醇胺(OEA)是動(dòng)物體內(nèi)的一種脂肪酸乙醇胺類化合物，是過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體α(PPARα)的一個(gè)具有高親和性的天然配體［1］。PPARα的合成配體已成為治療高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的一線藥物［2］，但長(zhǎng)期應(yīng)用該類藥物易引起肝臟損傷［3］。因此，尋找降血脂效果明顯且毒副作用少的新型PPARα激動(dòng)劑具有積極的臨床意義。近年來(lái)研究表明，OEA具有抑制食欲和抗肥胖等作用［1］，但其對(duì)血脂代謝及肝臟的影響少見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在觀察OEA對(duì)高脂血癥模型大鼠血脂代謝、肝臟脂質(zhì)水平及過(guò)氧化脂質(zhì)的影響，為進(jìn)一步研究OEA的藥理作用提供依據(jù)。

1 材料

OEA，廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系合成;膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測(cè)定試劑盒，北京北化康泰試劑有限公司;考馬斯亮藍(lán)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒，南京建成生物工程研究所。

雄性SD大鼠，體重(100±5)g購(gòu)于上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào):SCXK(滬)2007-0005。

SpectraMax-M2多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)分子儀器公司;CM 1850 UV冰凍切片機(jī)，德國(guó)萊卡公司;ECLIPSE 50I倒置顯微鏡，日本尼康公司。

2 方法

2.1 造模與分組

動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。大鼠按血脂水平隨機(jī)分成5組:即正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，OEA低、中、高劑量組。正常對(duì)照組給予普通飼料，其余各組均給予高脂飼料造模。高脂飼料組成為［4-5］:2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、10%豬油、5%黃豆、5%蔗糖、77.5%基礎(chǔ)飼料。造模14 d后，各治療組分別腹腔注射OEA(10，20，30mg/kg)，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予生理鹽水，1次/d。正常對(duì)照組繼續(xù)給予普通飼料，其他組繼續(xù)給予高脂飼料，持續(xù)21 d。每周測(cè)定體重，動(dòng)物處理前12 h禁食不禁水，然后以4%水合氯醛10mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，取肝臟稱重后保存于－80℃，供肝組織生化指標(biāo)測(cè)定用。另取相應(yīng)部位肝臟分別以4%多聚甲醛溶液固定，病理切片觀察肝組織中脂肪沉積情況。

2.2 血清指標(biāo)和肝臟系數(shù)測(cè)定

血清 TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT 按試劑盒說(shuō)明測(cè)定。肝臟系數(shù)=肝重(g)/鼠重(100 g)。

2.3 組織學(xué)觀察

肉眼觀察肝臟后，每鼠取肝臟相應(yīng)部位迅速制作冰凍切片，油紅O染色，200倍光鏡下觀察脂質(zhì)在肝臟組織中的沉積，脂肪為紅色著色。

2.4 肝脂質(zhì)和肝組織中MDA、GSH-Px測(cè)定

每鼠稱取相應(yīng)部位肝組織200mg，加三氯甲烷-甲醇(1∶1)至2mL后冰浴勻漿，勻漿液于4℃靜置24 h后，3 000 r/min離心10 min，室溫放置12 h以上揮去上層液體，抽干殘余液體，加入無(wú)水乙醇1mL，取上清分別按試劑盒方法測(cè)定肝中的TC和TG含量［6］。另稱取相應(yīng)部位肝組織200mg，加冰生理鹽水2mL勻漿，離心取上清，分別按試劑盒方法測(cè)定MDA、GSH-Px和蛋白含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 5(GraphPad Software Inc，USA)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以(±s)表示，兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 OEA對(duì)高脂血癥大鼠血脂代謝的影響

與正常對(duì)照組相比較，高脂血癥模型組大鼠血清TC、TG和LDL-C明顯升高(P＜0.01)，HDL-C明顯降低(P＜0.01)，表明大鼠高脂模型造模成功。連續(xù)給藥21 d后，OEA能明顯地降低高脂血癥大鼠血清 TC、TG、LDL-C 的水平(P＜0.01)，同時(shí)對(duì)血清HDL-C有一定的升高作用(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 OEA對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響(n=10，±s)Tab.1 Effect of OEA on serum lipid levels in hyperlipidemic rats(n=10，±s)

表1 OEA對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響(n=10，±s)Tab.1 Effect of OEA on serum lipid levels in hyperlipidemic rats(n=10，±s)

與模型對(duì)照組相比:1P＜0.05，2 P＜0.01 1P＜0.05，2 P＜0.01 vs model group

組 別 劑量/(mg/kg) TG/(mmol/L) TC/(mmol/L) HDL/(mmol/L) LDL/(mmol/L)正常對(duì)照組模型對(duì)照組OEA低劑量組OEA中劑量組OEA高劑量組－－1 0 20 30 0.34±0.082 1.65±0.46 1.18±0.471 0.69±0.172 0.50±0.182 1.19±0.242 5.87±1.84 5.31±1.39 3.53±0.982 3.38±1.292 1.05±0.192 0.53±0.07 0.66±0.24 0.78±0.102 0.84±0.212 0.73±0.162 2.46±1.47 1.82±1.39 0.91±0.651 0.74±0.582

3.2 OEA對(duì)高脂血癥大鼠體重、肝重、肝臟系數(shù)及肝功能指標(biāo)的影響

與正常對(duì)照組相比較，高脂血癥模型組大鼠血清ALT水平、肝重和肝臟系數(shù)明顯升高(P＜0.05或0.01)。連續(xù)給藥21 d后，OEA能明顯降低高脂血癥大鼠血清ALT、體重、肝重和肝臟系數(shù)(P＜0.05或 0.01)。見(jiàn)表2。

3.3 OEA對(duì)高脂血癥大鼠肝組織中TC、TG、MDA和GSH-Px的影響

與正常對(duì)照組相比較，高脂血癥模型組大鼠肝組織中TC、TG和MDA明顯升高(P＜0.01)，GSHPx明顯降低(P＜0.01)。連續(xù)給藥21 d后，OEA能明顯降低高脂血癥大鼠肝組織中TC、TG和MDA水平(P＜0.05或 0.01)，升高 GSH-Px活力(P＜0.01)。見(jiàn)表3。

3.4 組織學(xué)觀察

肉眼觀察空白對(duì)照組肝組織無(wú)異常變化，模型對(duì)照組肝組織呈無(wú)光澤的灰黃色，肝臟體積明顯增大;OEA各劑量組肝組織顏色較空白對(duì)照組顏色稍淺，光澤度稍差，體積較模型對(duì)照組減小。肝臟冰凍切片脂質(zhì)染色結(jié)果表明，空白對(duì)照組肝細(xì)胞內(nèi)基本未見(jiàn)脂滴，基本無(wú)著色;模型對(duì)照組肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量脂滴，呈大面積著色，其中肝小葉中央?yún)^(qū)著色較深，邊緣略淺;OEA各劑量組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴較模型對(duì)照組有所減少，著色面積和深度隨劑量增加有減少趨勢(shì)。見(jiàn)圖1。

表2 OEA對(duì)高脂血癥大鼠血清ALT、體重、肝重和肝臟系數(shù)的影響(n=10，±s)Tab.2 Effect of OEA on serum ALT，body weight，hepatic weight，and coefficient of hepatic weight in hyperlipidemic rats(n=10±s)

表2 OEA對(duì)高脂血癥大鼠血清ALT、體重、肝重和肝臟系數(shù)的影響(n=10，±s)Tab.2 Effect of OEA on serum ALT，body weight，hepatic weight，and coefficient of hepatic weight in hyperlipidemic rats(n=10±s)

與模型對(duì)照組相比:1 P＜0.05，2 P＜0.011 P＜0.05，2 P＜0.01 vs model group

組 別 劑量/(mg/kg) 體重/g 肝重/g 肝臟系數(shù)/(g/100 g) ALT/(u/L)正常對(duì)照組模型對(duì)照組OEA低劑量組OEA中劑量組OEA高劑量組－－1 0 20 30 277±14 286±23 251±262 245±142 230±312 12.0±0.82 16.1±1.3 12.6±1.62 12.1±1.62 11.6±1.52 4.33±0.172 5.65±0.47 5.09±0.87 4.85±0.711 4.72±0.602 27.5±7.91 41.6±16.6 30.9±6.5 19.8±10.72 17.1±7.32

表3 OEA對(duì)高脂血癥大鼠肝組織中TC、TG、MDA和GSH-Px的影響(n=10，±s)Tab.3 Effect of OEA on liver tissue TC，TG，MDA and GSH-Px in hyperlipidemic rats(n=10，±s)

表3 OEA對(duì)高脂血癥大鼠肝組織中TC、TG、MDA和GSH-Px的影響(n=10，±s)Tab.3 Effect of OEA on liver tissue TC，TG，MDA and GSH-Px in hyperlipidemic rats(n=10，±s)

與模型對(duì)照組相比:1 P＜ 0.05，2 P＜ 0.011 P＜ 0.05，2 P＜ 0.01 vs model group

組 別 劑量/(mg/kg)TC/(mg/g)TG/(mg/g)MDA/(μmol/g Prot)GSH-Px/(u/mg Prot)正常對(duì)照組模型對(duì)照組OEA低劑量組OEA中劑量組OEA高劑量組－－1 0 20 30 0.91±0.142 4.28±0.52 4.20±0.48 4.08±0.42 3.63±0.551 4.03±0.962 14.03±2.73 7.98±3.082 7.58±2.132 7.51±2.352 1.56±0.242 2.56±0.77 1.64±0.302 1.61±0.242 1.61±0.412 578.3±95.12 429.2±34.9 492.3±27.92 527.5±42.42 589.4±75.62

圖1 各組大鼠肝臟冰凍切片油紅O染色(×200)Fig.1 Oil red O staining of liver frozen slices from control，model and drug-treated rats(×200)

4 討論

OEA是PPARα的內(nèi)源性高親和力配體，在激活PPARα?xí)r存在結(jié)構(gòu)選擇性，激活PPARα的半數(shù)有效濃度(EC50)僅為120 nmol/L，并可通過(guò)激活核受體PPARα調(diào)節(jié)進(jìn)食和體重［7］。研究表明，OEA的抗肥胖作用與其激活PPARα刺激脂肪分解有關(guān)［8］。本研究觀察到，OEA亦能顯著降低高脂血癥大鼠體重，與文獻(xiàn)報(bào)道［8］一致，同樣表明OEA調(diào)節(jié)體重與其調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝有關(guān)。

PPARα與脂質(zhì)代謝關(guān)系密切，貝特類 PPARα激動(dòng)劑主要通過(guò)激活脂蛋白酯酶、抑制載脂蛋白B的合成等作用降低血中TG，同時(shí)可以增強(qiáng)載脂蛋白A-1的表達(dá)，升高血中HDL-C，進(jìn)而預(yù)防高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)展［9］。有報(bào)道，OEA同樣具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的潛力［10］。本研究結(jié)果顯示，飼喂高脂飼料21 d后，大鼠血清的TG、TC和LDL-C均比飼喂正常飼料的大鼠血清的相應(yīng)指標(biāo)有顯著性升高，且HDL-C顯著性降低，而給予不同劑量的OEA后，TG、TC和LDL-C均相應(yīng)降低，HDL-C升高，且有劑量依賴性。此結(jié)果表明，OEA具有調(diào)節(jié)血脂作用，進(jìn)而推測(cè)其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有防治潛力。

高脂血癥是導(dǎo)致脂肪肝的重要因素之一。長(zhǎng)期攝入高脂飲食會(huì)導(dǎo)致高脂血癥、肝內(nèi)TG合成增加，當(dāng)TG過(guò)量超過(guò)肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)能力時(shí)則導(dǎo)致TG在肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)堆積，壓迫肝血竇逐漸壞死，而肝臟的脂肪病變又會(huì)影響脂質(zhì)代謝，從而加重高脂血癥［11］。本研究結(jié)果表明，在給予OEA治療21 d后可明顯降低高脂血癥大鼠肝臟 TG、TC，肝重及肝臟系數(shù)，血清ALT，肝臟MDA水平，升高GSH-Px活力，表明OEA可調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝，改善肝功能，其清除自由基作用可能與存在某些高水平的內(nèi)源性抗氧化劑(GSH)有關(guān)。結(jié)果提示OEA可能通過(guò)調(diào)節(jié)血脂及肝臟脂質(zhì)代謝，提高肝臟自由基清除酶的活性，抵抗自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化，減輕肝臟自由基損傷，對(duì)肝臟具有一定保護(hù)作用。

本研究表明OEA具有較好的降血脂及肝臟保護(hù)作用。OEA由于口服后易被水解［12］，故本文采用腹腔注射給藥的方式。然而OEA兼具高效低毒性的優(yōu)勢(shì)，表明其有潛力作為治療高脂血癥的一種先導(dǎo)化合物，為今后開(kāi)發(fā)安全有效的降血脂藥物提供思路。

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