李明慧，王桂敏

(遼寧醫(yī)學(xué)院 1.研究生學(xué)院，2.附屬第一醫(yī)院 中醫(yī)科，遼寧 錦州 121001)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是指絕經(jīng)后婦女由于卵巢功能下降，雌激素水平急劇下降，骨吸收大于骨形成，以骨量減少，骨小梁變細(xì)、斷裂、數(shù)量減少，皮質(zhì)骨多孔、變薄為特征，以至骨的脆性增高及骨折危險性增加的一種全身性骨病。它是目前最為常見的骨代謝失調(diào)性疾?。?］。本研究旨在觀察甘草附子湯對去卵巢大鼠成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原(ColⅠ)代謝和破骨細(xì)胞組織蛋白酶K(Cath K)表達的影響，探求溫腎健脾方對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的防治作用。

1 材料

甘草附子湯出自醫(yī)圣張仲景《傷寒論》的原方［2］，由甘草、附子、白術(shù)、桂枝組成，自制;苯甲酸雌二醇(批號201009)，上海第九制藥廠生產(chǎn)。

Ⅰ型前膠原羧基末端前肽(PICP)和Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽(ICTP)測定試劑盒，美國RB公司;ColⅠ、Cath K試劑，購于北京博奧森生物科技有限公司。

SD雌性大鼠，3月齡，體重(240±20)g，本校動物實驗研究中心，合格證號:遼實動2010-0015。

2 方法

2.1 分組

健康SD大鼠40只，雌性，3月齡，體重(240±20)g，分為5組，每組8只，分別為假手術(shù)組、模型組、甘草附子湯高、低劑量組和雌激素組。

2.2 造摸

去卵巢大鼠模型是目前公認(rèn)為與臨床最接近的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型［3］。腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉，取俯臥位，剪去背毛，常規(guī)消毒，鋪手術(shù)巾;取背側(cè)正中切口，在背部1-6腰椎位置剪開皮膚，向雙側(cè)鈍性分離，用止血鉗拉出游離的脂肪組織，找到粉紅色的卵巢，在其與子宮連接處用0號絲線結(jié)扎，剪去卵巢組織，止血，并向腹腔內(nèi)滴入鏈霉素注射液(8萬單位/mL)數(shù)滴，再作肌層、皮膚縫合［4］。假手術(shù)組僅摘除卵巢附近的脂肪組織一塊。術(shù)后大鼠活動正常，可自行飲水?dāng)z食。

2.3 給藥

造模1周后分別給藥，假手術(shù)組和模型組灌胃等量水，甘草附子湯組灌胃甘草附子湯，高劑量組2.86mL/g，低劑量組1.43mL/g，雌激素組給予苯甲酸雌二醇肌注1.5mg/kg，3次/周，共12周。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)的測定取右側(cè)股骨放入10%甲醛溶液中固定24 h以上，EDTA脫鈣，HE染色，制作病理學(xué)切片，在光鏡下觀察骨小梁的變化并攝像。

2.4.2 骨生化指標(biāo)的測定PICP和ICTP采用酶聯(lián)免疫吸附法按試劑盒說明進行測定。

2.4.3 分子生物學(xué)指標(biāo)的測定免疫組化法測定Cath K和ColⅠ蛋白。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，所有數(shù)據(jù)均用(±s)表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用LSD法進行顯著性檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠骨組織形態(tài)學(xué)觀察

結(jié)果見圖1。假手術(shù)組大鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁數(shù)目較多，厚度較均勻，形成立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖1A)。模型組與假手術(shù)組比較，大鼠骨小梁數(shù)目明顯減少、變細(xì)、厚薄不均，間距增大，形狀各異，立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)受到破壞，骨髓腔擴大，部分區(qū)域可見大量的脂肪細(xì)胞(圖1B)。甘草附子湯高劑量組骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)。甘草附子湯低劑量組、高劑量組、雌激素組與模型組相比，骨小梁數(shù)目有所增多，但低劑量組不如高劑量組明顯。

圖1 為甘草附子湯對各組大鼠的骨小梁影響Fig.1 The influence of Gancaofuzi Decoction on bone trabeculae

3.2 甘草附子湯對ColⅠ蛋白表達的影響

結(jié)果見表1。ColⅠ蛋白主要表達在成骨細(xì)胞胞漿及細(xì)胞間質(zhì)，陽性染色為棕黃色或深棕黃色纖維狀或顆粒狀。在骨細(xì)胞胞漿中亦有少量表達。光鏡下觀察各組照片可以發(fā)現(xiàn)，甘草附子湯高、低劑量組、雌激素組和假手術(shù)組蛋白陽性。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠皮質(zhì)骨及骨小梁中染色較淺，甘草附子湯高劑量組、低劑量組、雌激素組的灰度比模型組有所增加。

3.3 甘草附子湯對Cath K蛋白表達的影響

結(jié)果見表1。Cath K蛋白主要表達在骨小梁周圍的破骨細(xì)胞胞漿中，成骨細(xì)胞周圍亦可見到少量陽性顆粒，陽性染色為棕黃色。光鏡下觀察各組照片可見，Cath K蛋白的表達在模型組比假手術(shù)組明顯增多，比甘草附子湯組和雌激素組顯著減少。

表1 各組的免疫組化染色的平均IOD值(×103)(±s)Tab.1 Group immunohistochemical stains average IOD values(×103)((±s)

表1 各組的免疫組化染色的平均IOD值(×103)(±s)Tab.1 Group immunohistochemical stains average IOD values(×103)((±s)

與模型組比較:1 P＜0.05，2 P＜0.01;與假手術(shù)組比較:3 P＜0.01Compared with model group:1 P＜0.05，2 P＜0.01;Compared with normal control group:3P＜0.01

組 別 ColⅠCath K假手術(shù)組26.7±3.0 18.7±3.8模型組 16.6±4.53 78.9±5.03中藥高劑量組 24.9±3.92 23.8±3.41中藥低劑量組 21.2±4.01 21.3±3.3雌激素組 25.4±3.02 22.5±3.72

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用Image Pro Plus4.1圖像分析系統(tǒng)進行分析，每張片子選取不重疊的5個視野，計算陽性區(qū)域的積分光密度(integra optical density，IOD)計算其平均值。

3.4 PICP和ICTP

結(jié)果見表2。治療3個月后，甘草附子湯高劑量組和雌激素組血清PICP與模型組比較，顯著升高(P＜0.05);甘草附子湯高劑量組和雌激素組血清ICTP水平與模型組比較，顯著下降(P＜0.05);甘草附子湯高劑量組與雌激素組比較沒有顯著差異(P＞0.05)。而甘草附子湯低劑量組與模型組差異不顯著。

4 討論

表2 各組大鼠PICP，ICTP表達(±s，n=8)Tab.2 Each rat，PICP ICTP expression(±s，n=8)

表2 各組大鼠PICP，ICTP表達(±s，n=8)Tab.2 Each rat，PICP ICTP expression(±s，n=8)

與模型組比較:1 P＜0.05;與假手術(shù)組比較:2 P＜0.05Compared with model group:1 P＜0.05;Compared with normal control group:2 P＜0.05

組 別 PICP/(μg/L) ICTP/(μg/L)假手術(shù)組79.890±16.547 2.924±0.351模型組 77.660±9.6782 3.478±0.2972中藥高劑量組 94.437±12.4381 3.194±0.4031中藥低劑量組 83.875±13.506 3.032±0.391雌激素組 95.538±15.7841 3.300±0.4281

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為“腎主骨，生髓”，所以研究抗骨質(zhì)疏松藥物多從補腎藥物著手［5-6］，在大量臨床實踐中，結(jié)合中醫(yī)“腎為先天之本，脾為后天之本”“脾腎同治”，提出溫腎壯骨，健脾益氣為治則。治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，療效顯著。故選取此方為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的老方新用。

現(xiàn)代藥理研究表明，甘草附子湯中附子、桂枝與甘草有抗炎作用。在PMOP中TNF-α及IL-2的炎性因子通過刺激軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞減少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解并產(chǎn)生膠原酶原和其他中性蛋白酶，釋放骨鈣等，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。附子，主要成分是生物堿等物質(zhì)，主要抗炎成分是烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿，其抗炎機制可能與中樞和組織中的前列腺素有關(guān)［7］。甘草，目前已分離100多種黃酮類化合物、18種氨基酸、香豆素及多種生物堿［8］，甘草酸單銨鹽對小鼠的炎性因子TNF-α及前列腺素具有明顯的抑制作用。白術(shù)主要含內(nèi)酯類、揮發(fā)油類和多糖類物質(zhì)［9］，可降低關(guān)節(jié)液中 TNF-α、NO的生成來抑制炎癥的反應(yīng)。桂枝主要成分為揮發(fā)油，其中主要桂皮醇，主要通過抑制關(guān)節(jié)液中炎性細(xì)胞因子PGE2的活性和炎性介質(zhì)的含量，來發(fā)揮作用［10］。因此，甘草附子湯通過降低炎性因子TNF-α及IL-2，防止破骨細(xì)胞生成，從而減少骨浸蝕和骨破壞，降低骨質(zhì)疏松的發(fā)病率。

成骨細(xì)胞增殖階段基因表達的ColⅠ是人體最豐富的膠原類型，約占骨基質(zhì)的80%～90%，它是構(gòu)成骨的重要成分［11-12］。ColⅠ在合成纖維過程中，在特定蛋白的作用下水解形成PICP并進入血液，因此，血中PICP水平反映了膠原合成速率成骨細(xì)胞的活性和膠原合成速率［13-15］。ColⅠ降解時，釋放一種成熟的也是唯一的一種交聯(lián)物ICIP［16-17］，它以完整的免疫原性蛋白形式進入血液中，其與ColⅠ降解的比例為1∶1。因此，血清中ICTP是反映骨吸收高度敏感的特異性指標(biāo)。所以，聯(lián)合檢測血清中PICP和ICTP的水平直接反映了骨Ⅰ型膠原合成和降解狀態(tài)［18］。本實驗中，甘草附子湯組血清中的PICP水平顯著高于模型組(P＜0.05)，甘草附子湯高劑量組較低劑量組更為顯著，而對于ICTP，甘草附子湯組血清中的含量顯著低于模型組(P＜0.05)?？梢姡什莞阶訙梢源龠M骨形成，同時抑制了骨吸收，對去卵巢大鼠所致骨質(zhì)疏松有重要的防治作用。

Cath K是破骨細(xì)胞分泌的一種溶酶體酶，其生理作用底物正是在有機骨基質(zhì)中含量豐富的ColⅠ。Cath K通過作用于ColⅠ蛋白的N端及C端三股螺旋處而降解骨纖維膠質(zhì)，它對成骨膠原的降解能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他各種金屬蛋白酶(MMPs)，是骨吸收過程中的一個關(guān)鍵酶［20-21］。在本實驗中，模型組的Cath K活性明顯提高，甘草附子湯組及雌激素組Cath K活性明顯降低，其中甘草附子湯高劑量組與雌激素組無明顯差異。

綜上所述，甘草附子湯通過下調(diào)破骨細(xì)胞Cath K的表達來抑制去卵巢大鼠骨組織中成骨細(xì)胞ColⅠ蛋白的降解，增加骨小梁的數(shù)量，改善骨小梁的結(jié)構(gòu)，減低骨的轉(zhuǎn)換率，從而達到甘草附子湯對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松預(yù)防的目的。

［1］Lane N E.Epidemiology，etiology and diagnosis of osteoporosis［J］.Am JObstet Gynecol，2006，194(2):S3-S11.

［2］王慶其.學(xué)習(xí)仲景方用甘草的臨床體會［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2008，48(2):11-13.

［3］Uppel M E，Miller L M，Burr D B.The effect of the microscopic and nanoscale structureon bone fragility［J］.Osteoporos Int，2008，19(9):1251-1265.

［4］陳 東，王連唐，陳子怡，等.去卵巢后大鼠不同部位的骨組織計量學(xué)與骨密度研究［J］.中國骨質(zhì)疏松雜志，2002，8(3):208-210.

［5］孔月晴，王新江.骨質(zhì)疏松證治及腎主骨理論的科學(xué)性［J］.中國醫(yī)藥學(xué)刊，2004，22(4):636-640.

［6］王 亭，徐暾海.附子甘草配伍研究進展［J］.中草藥，2009，40(8):1332-1334.

［7］續(xù)海訓(xùn)，徐康雅.參附注射液中附子成分分析［J］.中醫(yī)雜志，2003，44(9):677-679.

［8］蘇俊喜，周 穎，閆文軍，等.甘草有效成分應(yīng)用的研究進展［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2010，31(8):111-113.

［9］Li CQ，He L C，Jin JQ，etal.Atractylenolide I and Atr-actylenolideⅢinhibit lipopolysaccharide-induced TNF-αand NO production in macrophages［J］.Phytotherapy Res，2007，21(4):347-351.

［10］吳修紅，劉麗佳，王喜軍.桂枝茯苓丸及組成中藥化學(xué)成分研究進展［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2010，38(6):102-106.

［11］袁紹輝，劉 偉，吳濱奇，等.骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中Ⅰ，Ⅱ型膠原蛋白表達與其力學(xué)性能［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(2):208-212.

［12］趙良軍，彭芬芬，莊 薇，等.骨質(zhì)疏松大鼠膝關(guān)節(jié)組織總膠原、Ⅰ型及Ⅱ型膠原蛋白的含量變化［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，14(2):205-207.

［13］蘇友新，邢海清，鄭 良.強骨寶對糖尿病性骨質(zhì)疏松大鼠骨膠原代謝的影響［J］.中國骨質(zhì)疏松雜志，2006，3(12):289-291.

［14］陳樹清，周厚明，孫保國.補腎方對去卵巢大鼠血清中PICP、ICTP 的影響［J］.中國中醫(yī)骨傷科雜志，2009，3(13):13-14.

［15］涂平生，徐 杰.金雀異黃酮對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合的實驗研究［J］.解剖學(xué)研究，2005，2(27):108-112.

［16］楊 光，張 燕.骨質(zhì)疏松骨代謝標(biāo)志物研究進展［J］.廣州醫(yī)藥，2006(1):8-10 .

［17］Garnero P，F(xiàn)erreras M，Karsdal M A，etal.The type Icollagen fragments ICTP and CTX reveal distinct enzymatic pathways of bonecollagendegradation［J］.J Bone Miner Res，2003，18(5):859-867.

［18］Sigrist I M，Gerhardt C，Alini M，etal.The long-term effects ofovariectomy on bone metabolism in sheep［J］.JBone Miner Metab，2007，25(1):28-35.

［19］曾廣智，譚寧華.組織蛋白酶及其抑制劑研究進展［J］.云南植物研究，2005，27(4):334-337.

［20］Ravikumar M，Pavan S，Bairy S，etal.Virtual screening of cathepsink inhibitorsusing docking and pharmacophoremodels［J］.Chem Biol Drug Des，2008，71(6):554-562.