王文濤 陳彬 傅筑蔭

摘要：采用ＰＣＲ和直接測(cè)序的方法測(cè)定興義矮腳雞和長順綠殼蛋雞線粒體ＤＮＡ控制區(qū)全序列，分析比較兩者ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ序列３個(gè)區(qū)的變異。結(jié)果表明，興義矮腳雞和長順綠殼蛋雞線粒體ＤＮＡ控制區(qū)全序列長分別為１ ２３１和１ ２３０ ｂｐ，其中興義矮腳雞ｍｔＤＮＡ控制區(qū)的堿基摩爾分?jǐn)?shù)分別為Ａ ２６．９２％、Ｔ ３３．４１％、Ｇ １３．３９％、Ｃ ２６．２９％，長順綠殼蛋雞的分別是Ａ ２７．１３％、Ｔ ３３．５８％、Ｇ １３．２０％、Ｃ ２６．０９％。ｔ檢驗(yàn)顯示兩種貴州地方雞種間線粒體ＤＮＡ控制區(qū)堿基Ａ與Ｃ的含量差異顯著，說明Ａ與Ｃ之間的顛換較多。興義矮腳雞和長順綠殼蛋雞的遺傳距離是０．０３８ ６，根據(jù)分子鐘計(jì)算，二者大約在１９３萬年前分歧進(jìn)化。

關(guān)鍵詞：線粒體ＤＮＡ控制區(qū)；興義矮腳雞；長順綠殼蛋雞；遺傳變異

中圖分類號(hào)：Ｑ３４３．３文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）15－3114-02

Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｔＤＮＡ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｔｗｏ Kｉｎｄｓ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｉｃｋｅｎ

ＷＡＮＧ Ｗｅｎ－ｔａｏa，ＣＨＥＮ Ｂｉｎa，ＦＵ Ｚｈｕ－ｙｉｎb

（a． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ， Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｌａｔｅａｕ Ｍｏｕｎｔａｉｎｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ；

b． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＰＣＲ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ ｉｎ Ｘｉｎｇｙｉ Ｂａｎｔａｍ Ｃｈｉｃｋｅｎ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ ｓｈｕｎ Ｂｌｕｅ－ｓｈｅｌｌｅｄ Ｅｇｇ Ｃｈｉｃｋｅｎ． Ｔｈｅ Ｄ－ｌｏｏｐ ｏｆ Ｘｉｎｇｙｉ Ｂａｎｔａｍ ａｎｄ Ｃｈａｎｇｓｈｕｎ Ｂｌｕｅ－ｓｈｅｌｌｅｄ Ｅｇｇ Ｃｈｉｃｋｅｎ ｗａｓ

１ ２３１ ａｎｄ １ ２３０ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｌｏｎｇ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ molar fraction ｏｆ Ｘｉｎｇｙｉ Ｂａｎｔａｍ ｗａｓ Ａ ２６．９２％， Ｔ ３３．４１％， Ｇ １３．３９％， ａｎｄ Ｃ ２６．２９％ ， ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｍｐｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈａｎｇｓｈｕｎ Ｂｌｕｅ－ｓｈｅｌｌｅｄ Ｅｇｇ Ｃｈｉｃｋｅｎ ｗａｓ Ａ ２７．１３％， Ｔ ３３．５８％， Ｇ １３．２０％ ａｎｄ Ｃ ２６．０９％． Ｔｈｅ t－ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａ ａｎｄ Ｃ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍｔＤＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｃｈｉｃｋｅｎ ｂｒｅｅｄｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ． Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｂｒｅｅｄｓ ｗａｓ ０．０３８ ６． Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｃｋ， ｔｈｅ ｔｗｏ ｂｒｅｅｄｓ ｄｉｖｅｒｇｅｄ ａｎｄ ｅｖolved ａｂｏｕｔ １．９３ ｍｉｌｌｉｏｎ ｙｅａｒｓ ａｇｏ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ； Ｘｉｎｇｙｉ Ｂａｎｔａｍ chicken； Ｃｈａｎｇｓｈｕｎ Ｂｌｕｅ－ｓｈｅｌｌｅｄ Ｅｇｇ Ｃｈｉｃｋｅｎ； gｅｎｅｔｉｃ vａｒｉａｔｉｏｎ

線粒體ＤＮＡ控制區(qū)是非編碼基因區(qū)，在進(jìn)化過程中受環(huán)境的選擇壓力小，表現(xiàn)出進(jìn)化速率快和母系遺傳等特點(diǎn)，在鳥類的分類研究中常用作種系發(fā)生的分子標(biāo)記［１］。

在漫長的家雞養(yǎng)殖歷史中，貴州形成了豐富的地方雞品種資源。興義矮腳雞和長順綠殼蛋雞是兩種優(yōu)良的貴州地方雞種，近年來由于生存環(huán)境遭到破壞、引進(jìn)外地品種雜交改良等人為因素以及某些自然因素的影響，二者的開發(fā)利用受到限制［２，３］。對(duì)二者的親緣關(guān)系和起源分化的研究不僅可以弄清它們的親緣關(guān)系狀況，為進(jìn)一步選育和雜交配套提供理論基礎(chǔ)，還可探討人工選擇對(duì)同一個(gè)地理群體遺傳分化的影響。本研究通過比較興義矮腳雞和長順綠殼蛋雞兩類群間的ｍｔＤＮＡ序列變異，分析了二者的親緣關(guān)系。

１材料與方法

１．１試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用的興義矮腳雞、長順綠殼蛋雞各為１５個(gè)樣本。翅靜脈采血０．５～１．０ ｍＬ，肝素鈉抗凝，４ ℃保存?zhèn)溆谩２捎茫裕桑粒危幔恚?Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｋｉｔ試劑盒提取血樣中ＤＮＡ，－２０ ℃保存?zhèn)溆谩Ｅd義矮腳雞、長順綠殼蛋雞均由貴州大學(xué)科研雞場(chǎng)提供。

１．２ＰＣＲ反應(yīng)及測(cè)序

ＰＣＲ擴(kuò)增引物為ＰＨＤＬ（５′－ＡＧＧＡＣＴＡＣＧＧＣＴＴ

ＧＡＡＡＡＧＣ－３′）、ＰＨｌＨ（５′－ＴＴＡＴＧＴＧＣＴＴＧＡＣＣＧＡＧ

ＧＡＡＣＣＡＧ－３′）和Ｌ４００（５′－ＡＴＴＴＡＴＴＧＡＴＣＧＴＣＣＡ

ＣＣＴＣＡＣＧ－３′）、ＰＨＤＨ（５′－ＣＡＴＣＴＴＧＧＣＡＴＣＴＴＣＡＧ

ＴＧＣＣ－３′）（引物名稱末尾字母L、H分別代表輕鏈和重鏈）［４］。２５ μＬ ＰＣＲ反應(yīng)液中含ＤＮＡ樣品２ μＬ，上下游引物各０．８ μＬ，２×Ｔａq ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ試劑１２．５ μＬ，ｄｄ Ｈ２Ｏ ８．９ μＬ。ＰＣＲ循環(huán)參數(shù)（３０循環(huán)）為９４ ℃預(yù)變性３ ｍｉｎ，９４ ℃變性３０ ｓ，６１～６３ ℃復(fù)性３０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，最后７２ ℃延伸４ ｍｉｎ。用２％瓊脂糖凝膠檢測(cè)ＰＣＲ產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)ＴＩＡＮｇｅｌ Ｍｉｄｉ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ試劑盒回收純化后由北京諾賽基因組研究中心完成測(cè)序。

１．３序列分析

利用Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ８對(duì)原始ＤＮＡ序列進(jìn)行對(duì)位排列，并經(jīng)人工仔細(xì)核查后，利用ＤｎａＳＰ ４．０［５］提取變異位點(diǎn)。利用ＭＥＧＡ ４．０［６］統(tǒng)計(jì)堿基組成，并計(jì)算基于Ｋｉｍｕｒａ雙參數(shù)模型的遺傳距離。以原雞為外群（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號(hào)：ＡＢ００７７２０），構(gòu)建ＮＪ分子系統(tǒng)發(fā)生樹。

２結(jié)果

２．１ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ區(qū)序列變異

用Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ８對(duì)原始ＤＮＡ序列進(jìn)行對(duì)位排列和剪切對(duì)齊后，得到興義矮腳雞、長順綠殼蛋雞線粒體ＤＮＡ控制區(qū)序列全長分別為１ ２３１ ｂｐ、１ ２３０ ｂｐ。與興義矮腳雞相比，長順綠殼蛋雞ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ區(qū)全序列在第４４６位點(diǎn)缺失。兩者之間共發(fā)現(xiàn) ２３個(gè)變異位點(diǎn)，包括１１個(gè)轉(zhuǎn)換和１２個(gè)顛換，11個(gè)轉(zhuǎn)換分別是５次Ｔ－Ｃ間轉(zhuǎn)換，６次Ａ－Ｇ間轉(zhuǎn)換；顛換中，Ａ－Ｔ間２次，Ｇ－Ｔ間１次，Ａ－Ｃ 間８次，Ｇ－Ｃ間１次。

興義矮腳雞和長順綠殼蛋雞ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ區(qū)Ⅰ區(qū)有１３個(gè)變異位點(diǎn)，占總變異數(shù)的５６．５％，序列變異率為４．１１％；Ⅱ區(qū)有 ２個(gè)變異位點(diǎn)，序列變異率為０．４３％；Ⅲ區(qū)有８?jìng)€(gè)變異位點(diǎn)，序列變異率為１．７９％。

２．２ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ區(qū)序列堿基組成

興義矮腳雞、長順綠殼蛋雞ｍｔＤＮＡ控制區(qū)的堿基含量見表１。由表１可見，兩種貴州地方雞Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ ４種堿基的平均摩爾分?jǐn)?shù)分別為２７．０２％、３３．４９％、１３．２９％、２６．１９％，Ａ＋Ｔ含量高于Ｇ＋Ｃ，這符合雞ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ區(qū)是Ａ＋Ｔ富含區(qū)、而Ｔ含量最高的特點(diǎn)，表現(xiàn)出ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ區(qū)堿基組成的偏倚性。ｔ檢驗(yàn)顯示兩種貴州地方雞種間線粒體ＤＮＡ控制區(qū)堿基Ａ與Ｃ的含量差異顯著（Ｐ＜０．０５），說明Ａ與Ｃ之間的顛換較多。

２．３系統(tǒng)發(fā)生樹

基于Ｋｉｍｕｒａ雙參數(shù)模型計(jì)算興義矮腳雞與長順綠殼蛋雞的遺傳距離為０．０３８ ６，兩種貴州地方雞種與原雞的遺傳距離為０．２１０ ６。

依據(jù)測(cè)定的序列，以原雞為外群，構(gòu)建興義矮腳雞、長順綠殼蛋雞的ＮＪ分子系統(tǒng)發(fā)生樹（圖１）。興義矮腳雞、長順綠殼蛋雞在系統(tǒng)樹上各聚成一支，并且各支的置信度很高，特別是種間的置信度達(dá)到９９％。

３討論

鳥類ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ區(qū)的進(jìn)化速率為每百萬年２％［７，８］，以此計(jì)算興義矮腳雞與長順綠殼蛋雞的分歧進(jìn)化時(shí)間約為１９３萬年。但堿基轉(zhuǎn)換易飽和，因此可用顛換估算二者間的分歧時(shí)間。由于沒有貴州地方雞種進(jìn)化時(shí)間參考，我們以石雞和大石雞為參照。兩種雞ｍｔＤＮＡ Ｄ－ｌｏｏｐ區(qū)全序列的顛換數(shù)有１０個(gè)，其分歧時(shí)間約為１９０萬年［９］，堿基顛換速率為５．２６個(gè)／百萬年。興義矮腳雞和長順綠殼蛋雞間的堿基顛換數(shù)為１２個(gè)，由此推算二者的分歧時(shí)間大約為２２０萬年前，屬于更新世第二次寒冷期［１０］。貴州地處我國西南地區(qū)，可能是更新世第二次寒冷期嚴(yán)重的山脊冰川作用將二者隔離在不同的低地，最終分歧進(jìn)化成不同的地方雞種。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 劉益平，曾凡同，張思婉，等．幾種山地烏骨雞線粒體ＤＮＡ序列多態(tài)性分析［Ａ］． 家禽研究最新進(jìn)展——第十一次全國家禽學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集 ［Ｃ］．北京：中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)，２００３．１９８－２０１．

［２］ 潘周雄，張福平，曹娟，等．貴州長順綠殼蛋雞簡(jiǎn)介［Ｊ］．中國家禽，２００８，３０（４）：５３－５４．

［３］ 王文濤，陳彬，傅筑蔭，等．貴州地方雞種資源的現(xiàn)狀、存在問題及對(duì)策［Ｊ］．貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，２０１０，３８（８）：１５５－１５７．

［４］ ＲＡＮＤＩ Ｅ， ＬＵＣＣＨＩＮＩ Ｖ．０ｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｖｉａｎ ｇｅｎｕｓ Ａｌｅｃｔｏｒｉｓ［Ｊ］． Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ，１９９８，４７（４）：４４９－４６２．

［５］ ＲＯＺＡＳ Ｊ， ＲＯＺＡＳ Ｒ． ＤｎａＳＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３：ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１９９９，１５（2）：１７４-１７５．

［６］ ＴＡＭＵＲＡ Ｋ， ＤＵＤＬＥＹ Ｊ， ＮＥＩ Ｍ， ｅｔ ａｌ． ＭＥＧＡ４：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＭＥＧＡ） ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０ ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｂｏｉｌ Ｅｖｏｌ，２００７，２４（8）：ｌ５９６－１５９９．

［７］ ＫＬＢＩＮＳＫＬ D Ｏ Ｆ，GALLAGHER C，EBYNON C M，ｅｔ ａｌ． Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ， １９９４，３６８（６４７４）：８１７－８１８．

［８］ 劉益平，朱慶，曾凡同，等．原雞線粒體ＤＮＡ部分序列多態(tài)性分析［Ｊ］．畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，２００４，３５（２）：１３４－１４０．

［９］ 黃族豪，劉迺發(fā)，龍進(jìn)，等．從線粒體ＤＮＡ控制區(qū)基因比較石雞和大石雞的遺傳變異［Ｊ］．２００６，２８（３）：４２０－４２４．

［１０］ 李吉均，文世宣，張青松，等．青藏高原隆起的時(shí)代、幅度和形式的探討［Ｊ］．中國科學(xué)，１９７９（６）：６０８－６１６．