馬泉芳,魏 然,劉春林

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,長沙 410128)

β-羅勒烯 (β-ocimene)是近年來發(fā)現(xiàn)的 ,與植物防御相關(guān)的植物通訊 (plant-communication)信號分子[1],在自然界中包括兩個同分異構(gòu)體:順式-β-羅勒烯 (cis-β-ocimene) 和 反 式-β-羅 勒 烯 (trans-βocimene)。 β-羅勒烯是一種單萜 (monoterpenes)化合物。單萜是 C10類萜類化合物,由兩個異戊二烯結(jié)構(gòu)單元組成,以鏈狀、環(huán)狀及其衍生物的形式廣泛存在于植物揮發(fā)油和樹脂中[2,3]。這類產(chǎn)物在植物的種群競爭、吸引昆蟲傳粉、植食性昆蟲防御等方面發(fā)揮著重要作用[4～6]。

研究發(fā)現(xiàn),植物在受到外界的脅迫后,植株能釋放出VOCs(volatile organic compounds),VOCs中含有一系列小分子的萜類化合物[7,8]?，F(xiàn)在已經(jīng)了解到許多植物種類如:玉米、棉花、利瑪豆、馬鈴薯、煙草、擬南芥、番茄、地中海松、三葉草、月桃葉、黃瓜等等被節(jié)肢食草動物取食后,其葉片釋放的有機(jī)揮發(fā)物中都包含反式 -β -羅勒烯[7～10]。 已有研究結(jié)果表明 ,反式 -β-羅勒烯能激發(fā)與受害植株相鄰的植株產(chǎn)生誘導(dǎo)性防御反應(yīng)并改變相鄰植物體內(nèi)的代謝途徑,對病原微生物產(chǎn)生抗性或?qū)κ巢輨游锂a(chǎn)生驅(qū)趕作用[11～16]。劉春林等[17]以擬南芥為材料,分別選擇水楊酸信號傳導(dǎo)途徑啟動的指示基因 PR1與茉莉酸信號傳導(dǎo)途徑的指示基因PDF1.2基因片段為探針,運(yùn)用 Northern雜交的方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)β-羅勒烯能誘導(dǎo)完整植物中與水楊酸和茉莉酸有關(guān)防御基因的表達(dá),而且發(fā)現(xiàn)β-羅勒烯能解除水楊酸和茉莉酸的拮抗作用。這表明β-羅勒烯是一種與植物防御啟動密切相關(guān)的信號分子。

β-羅勒烯這種單萜揮發(fā)性有機(jī)物是由萜類合成酶(terpeniod synthase,T PS)催化合成的。萜類合酶類,以氨基酸序列相似度 40%為基準(zhǔn)將其分為 TPS-a～T PS-g 7個亞家族[18,19],它主要包括單萜合成酶(monoterpene synthase)、倍半萜合成酶(sesquiterpene synthase)和二萜合成酶 (diterpene synthase)。除直鏈的多聚萜類 (如橡膠)外,大多數(shù)萜類化合物都具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。單萜合酶分布于 TPS-b,T PS-d,TPS-f和 TPS-g 4個亞家族。單萜合酶基因表達(dá)受生物鐘調(diào)節(jié),表達(dá)量隨晝夜周期交替變換而出現(xiàn)高低變化。如金魚草月桂烯合酶、羅勒烯合酶,擬南芥月桂烯合酶、羅勒烯合酶基因的表達(dá)量和產(chǎn)物都呈現(xiàn)午后高、夜間低的晝夜交替規(guī)律[20,21]。

Aubourg等(2002)通過對擬南芥基因的序列分析發(fā)現(xiàn)擬南芥含有40個 TPS類似基因,并將這 40個相似基因組成的家族命名為 At TPS家族。At TPS03(Arabidopsis thaliana terpenoid synthase 03)基因是At TPS基因家族中的一員。 Jenny等人[22]通過cDNA克隆,鑒定了一個基因 At TPS03,它能編碼單萜合酶,這種單萜合酶能高特異性催化香葉基二磷酸生成β-羅勒烯。

為了研究β-羅勒烯的功能,需要獲得 At TPS03基因沉默的純合突變體。純合體的獲得將為進(jìn)一步研究At TPS03基因在植物防御、植物通訊方面的作用奠定良好的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)所用材料是從美國擬南芥生物資源中心訂購 AtT PS03基因的 T-DNA插入突變體材料 CS879103,通過 PCR檢測對其基因型進(jìn)行鑒定,獲得了8株穩(wěn)定的純合突變體株系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

At TPS03基因 T-DNA插入突變體 CS8791039(T4代)種子購自美國俄亥俄州立大學(xué) ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center),野生型擬南芥(Col-0生態(tài)型)種子由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 生物學(xué)試劑

2×Taq MasterMix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,100 bp plus Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司,Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit購自 Fermentas公司,引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng)

先將種子消毒,然后散播于盛有蛭石的小缽內(nèi),置于4℃恒溫黑暗培養(yǎng)室內(nèi)春化48h;春化后轉(zhuǎn)入人工生長室中培養(yǎng),環(huán)境條件為:恒溫22～24℃,光照強(qiáng)度為120～150μ mol/m2· s(1μ mol/m2· s=53.8 Lux),16 h光照 /8 h黑暗,相對濕度 75%,定時澆營養(yǎng)液。待其生長至 25 d左右時,取幼嫩葉用于 DNA分離。

1.2.2 單株植物總DNA提取

取擬南芥幼葉 2～3片于 1.5 mL離心管中,研棒研碎,至 65℃水浴鍋中水浴 15 min,加 2×CTAB DNA提取液 600μL和等體積氯仿∶異戊醇(24∶1),在渦漩器上混勻,14 000 rpm離心 7 min;取上清液至一新的 1.5 mL離心管中,加2倍體積無水乙醇,同時加上清液 1/10體積的 3 mol/L NaAC輕輕顛倒混勻(-20℃放置 20 min),14 000 rpm離心 10 min,吹干,溶于滅菌的超純水中后作為 PCR擴(kuò)增的DNA模板。

1.2.3 DN A的 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)體系為15μL:模板2μL,2×Taq MasterMix 7.5μL,正向引物 F 0.1μ L,反向引物R 0.1μL,用 ddH2O補(bǔ)足至 15μL。

PCR反應(yīng)條件。 (1)預(yù)變性,94℃,3 min;(2)變性 ,94℃ ,40 s;(3)退火 ,62℃ ,35 s,72℃延伸 45 s(從變性至延伸 35個循環(huán));(4)最后延伸,72℃,7 min。反應(yīng)結(jié)束 16℃保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的檢測

檢測 PCR產(chǎn)物一般利用 1.6%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,其中電泳緩沖液為 1× T AE,電壓為 5 V/cm,用EB進(jìn)行染色,PCR產(chǎn)物上樣量為 8μL,電泳結(jié)果用本實(shí)驗(yàn)室的凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.2.5 PCR引物的設(shè)計

每個T-DNA單株基因型的鑒定需要3條引物,分別是:LP,位于基因組上距離 T-DNA插入位點(diǎn)左斷臂600 bp;RP,位于距離 T-DNA插入位點(diǎn)右臂端 300 bp;T-DNA左斷臂引物 LB3(表1)。 PCR引物設(shè)計參照(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2html.)相關(guān)資料。

1.2.6 純合突變體中模板基因表達(dá)的 RT-PCR驗(yàn)證

待純合突變體生長至 32 d時,取 2株已被初步鑒定為純合子的植株和 1株野生型(Col-0),用剪刀在其蓮座葉上剪一刀,其中對每株純合子剪創(chuàng)2片,8 h后取樣,液氮速凍后,用 Trizol法提取RNA,用Fermentas公司的 Revert AidTM First Strand cDN A Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA,然后對這 3株材料的At TPS03進(jìn)行半定量RT-PCR分析,其中所用引物見表1。 PCR反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變 3 min,94℃50 s,61℃退火 40 s,72℃延伸 50 s,最后延伸 72℃ 8 min,16℃保存,擴(kuò)增 35個循環(huán)。以基因 Actin2為對照。

表1 PCR擴(kuò)增所用的引物及其序列Table 1 Primer sequences used for the PCRamplification

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR引物設(shè)計

原理如圖1所示。當(dāng)用 LP和 RP這對引物進(jìn)行PCR檢測時,在野生型植株(wild type,WT)和雜合子(heterozygous lines,HZ)植株中產(chǎn)生一條 PCR產(chǎn)物帶,分子量大約是 900 bp,而純合子 (homozygous lines,HM)植株中沒有 PCR產(chǎn)物形成;當(dāng)用 RP和 LB3這對引物 PCR檢測時,在野生型植株中沒有 PCR產(chǎn)物,而在雜合子植株和純合子植株中均有一條 PCR產(chǎn)物帶,分子量大小為 410+Nbp。

圖1 PCR引物設(shè)計原理a.PCR引物設(shè)計示意圖;b.電泳結(jié)果示意圖。來自http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2htmlFig.1 Principles of primer design of PCRa.Schematic diagram of primer design of PCR;B.Schematic diagram of Electrophoresis results

2.2 T-DNA插入位點(diǎn)鑒定結(jié)果

T-DNA突變體材料長至 25 d時,取 4株,提取基因組 DNA作為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,以一株野生型植株基因組 DNA作為對照模板。當(dāng)分別用 LP、RP和RP、LB3這兩對引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增時,根據(jù)電泳結(jié)果(圖2)可判斷,除了作為對照的 1號泳道,其他相鄰的兩個泳道中,當(dāng)有兩條分子量分別為 900 bp和 410+Nbp的 PCR產(chǎn)物時,說明該植株在該位點(diǎn)有 T-DNA插入,而且是雜合子植株(如 2和 3,6和 7號泳道 );當(dāng)只有一條分子量為410+Nbp的 PCR產(chǎn)物時,說明該植株在該位點(diǎn)有 T-DNA插入,而且是純合子植株(如4和5,8和9號泳道)。通過PCR擴(kuò)增和電泳結(jié)果分析,最后得到2株純合子植株,分單株收集種子。

待 T-DNA插入純合突變體材料長至 30 d時(圖3),其株型比 Col-0野生型小,抽薹早于 Col型。

2.3 純合子RT-PCR檢測

圖2 電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results

將已初步鑒定的 2株純合突變體與 1株野生型Col-0(圖3),用剪刀對蓮座葉進(jìn)行剪創(chuàng)傷處理,8 h后,分別提取總 RNA,對分離的RNA進(jìn)行 RT-PCR檢測,結(jié)果(圖4)顯示 2株純合突變體沒有擴(kuò)增產(chǎn)物,而野生型 Col-0有帶,說明 AtTPS03基因的表達(dá)因 T-DNA插入而被完全沉默了。 T-DNA插入位點(diǎn)的鑒定結(jié)果與 RT-PCR兩方面的結(jié)果證實(shí)鑒定的 T-DNA插入純合突變體可以用于下一步的 AtT PS03基因?qū)χ参锷L發(fā)育方面的研究。

圖3 a:Col-0野生型;b:T-DNA插入的純合子:2號 (為泳道中的 4和 5)和 3號(為泳道中的 8和 9)Fig.3 a:Columbia-0type;b:T-DNA insertion homozygous mutants:2(lane4,5)and3(lane8,9)

圖4 T-DNA插入純合子體內(nèi)AtTPS03基因的表達(dá)情況Fig.4 AtTPS03gene expression of T-DNA insertion homozygous mutants

待 T-DNA插入純合突變體材料長至50 d時(圖5),與 Col-0型相比,T-DNA插入純合子其株型變小,葉片有的輕微泛黃,果莢變短,莖稈變細(xì),成熟期早于 Col-0型。

3 討 論

圖5 a:Col-0野生型;b:T-DNA插入的純合子:2號和 3號Fig.5 a:Columbia-0type;b:T-DNA insertion homozygous mutants 2and 3

對 T-DNA插入突變體的鑒定,引物的設(shè)計一般是直接利用http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2html網(wǎng)頁提供的軟件。本實(shí)驗(yàn)也是根據(jù)T AIR官方網(wǎng)站公布的基因 AT 4G16740.1的 T-DNA插入位置,找到其突變體的類型,搜索到檢測所需的3條引物,對突變體進(jìn)行檢測,檢測結(jié)果小于 1 000 bp,與理論值1 044 bp有些出入,比網(wǎng)站上公布的結(jié)果小。

雙引物法檢測獲得的 T-DNA插入純合突變體,一定要對其進(jìn)行基因表達(dá)分析。因?yàn)閺睦碚撋现v,TDNA插入的片段比較大,插入突變往往使基因處于沉默狀態(tài),大多數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)這一理論。但是有時也會遇到,盡管是純合插入突變體,但是目標(biāo)基因還是能夠表達(dá)。筆者實(shí)驗(yàn)時就遇到過一次:得到的純合 TDNA插入突變體,插入位點(diǎn)是在基因的信號肽序列上,RT-PCR檢測結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)該基因能夠轉(zhuǎn)錄獲得有功能的 cDNA。

在相同培養(yǎng)條件下,發(fā)現(xiàn) AtTPS03基因純合突變體與野生型Col-0的形態(tài)有差異。突變體株型變小,蓮座葉葉片泛黃,出現(xiàn)提前衰老現(xiàn)象;側(cè)枝數(shù)目少,莖稈變細(xì),花型變小,果莢變短;成熟期早于 Col-0型。這種現(xiàn)象表明,AtT PS03基因可能參與調(diào)控植物的生長發(fā)育。所以本實(shí)驗(yàn)獲得的 AtTPS03基因純合突變體為進(jìn)一步研究β-羅勒烯的功能奠定了良好基礎(chǔ)。

[1]Bohlmann J,Croteau R.Diversity and variability of terpenoid defences in conifers:moleculargenetics,biochemistry and evolution of the terpenesynthase gene family in grand fir(Abies grandis)[J].Novartis Found Symp,1999,223:132-145.

[2]Bohlmann J,Martin D,Oldham N J,et al.Terpenoid secondary metabolism inArabidopsis thaliana:cDN A cloning,characterization,and functional expression of a myrcene/(E)-beta-ocimene synthase[J].Arch Biochem Biophys,2000,375(2):261-269.

[3]Lippert D,Chowrira S,Ralph SG,et al.Conifer defense against insects:Proteome analysis of Sitka spruce(Picea sitchensis)bark induced by mechanical wounding or feeding by white pine weevils(Pissodes strobi)[J].Proteomics,2007,7(2):248-270.

[4]Jarmo K Holopainen.M ultiple functions of inducible plant volatiles[J].Trends Plant Science,2004,9(11):529-533.

[5]Pichersky E,Gershenzon J.The formation and function of plant volatiles:perfumes for pollinator attraction and defense[J].Curr Opin Plant Biol,2002,5(3):237-243.

[6]Dudareva N,Pichersky E,Gershenzon J.Biochemistry of plant volatiles[J].Plant Physiol,2004,135(4):1893-1902.

[7]Par é PW,Tumlinson JH.Plant volatiles as a defense against insect herbivores[J].Plant Physiol,1999,121(2):325-332.

[8]Kessler A,Baldwin IT.Defensive function of herbivoreinduced plant volatile emissions in nature[J].Science,2001,291:2141-2144.

[9]Kappers IF,Aharoni A,van Herpen TW,et al.Genetic engineering of terpenoid metabolism attracts bodyguards toArabidopsis[J].Science,2005,309:2070-2072.

[10]Karban R,Baldwin IT.Induced responses to herbivory[J].Trends Ecol Evol,1998,13(2):83.

[11]Arimura G,Ozawa R,Shimoda T,et al.Herbivoryinduced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves[J].Nature,2000,406:512-515.

[12]Arimura G,Ozawa R,Kuqimiya S,et al.Herbivoreinduced defense response in a model legume.Twospotted spider mites induce emission of(E)-betaocimene and transcript accumulation of(E)-betaocimene synthase in Lotus japonicus [J]. Plant Physiology,2004,135(4):1976-1983.

[13]Farmer EE.Surface-to-air signals[J].Nature,2001,411:854-856.

[14]Godard KA,White R,Bohlmann J.Monoterpeneinduced molecular responses in Arabidopsis thaliana[J].Phytochemistry,2008,69(9):1838-1849.

[15]Navia-Giné WG,Yuan JS,Mauromoustakos A,et al.Medicagotruncatula (E)-beta-ocimenesynthase is induced by insect herbivory with corresponding increases in emission of volatile ocimene[J].Plant Physiology and Biochemistry,2009,47(5):416-425.

[16] Huang M,Abel C,Sohrabi R,et al.Variation of herbivore-induced volatile terpenes among Arabidopsis ecotypes depends of allelic difference and subcellular targeting of two terpene synthases,TPS02 and TPS03[J].Plant Physiology,2010,153(3):1293-1310.

[17]劉春林,阮 穎,官春云.β-羅勒烯信號分子誘導(dǎo)的防御基因表達(dá)模式 [J].科學(xué)通報,2004,49(22):2373-2374.

[18]Bohlmann J,MeyerGauen G,Croteau R.Plant terpenoid synthases:molecular biology and phylogenetic analysis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(8):4126,4133.

[19]Dudareva N,Martin D,Kish CM,et al.(E)-betaocimene and myrcene synthase genes of floral scent biosynthesis in snapdragon:function and expression of three terpene synthase genes of a new terpene synthase subfamily[J].Plant Cell,2003,15(5):1227-1241.

[20]Chen F,Tholl D,D'Auria JC,et al.Biosynthesis and emission of terpenoid volatiles from Arabidopsis flowers[J].Plant Cell,2003,15(2):481-494.

[21]Lu S,Xu R,JiaJW,et al.Cloning and functional characterizaton of a β-pinene synthase from Artemisia annuathat shows a circadian pattern of expression[J].Plant Physiol,2002,130(1):477-486.