朱元貴， 陳曉春， 陳志

(福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科，福建省老年醫(yī)學研究所，2 血液科，福建省血液病研究所，福建 福州 350001；3 Rush大學醫(yī)學中心藥理學系，美國伊利諾伊州 芝加哥市 60612)

妊娠期脂多糖接觸激活體內(nèi)TLR4信號通路引起胚胎腦內(nèi)炎癥應激

(福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科，福建省老年醫(yī)學研究所，2血液科，福建省血液病研究所，福建 福州 350001；3Rush大學醫(yī)學中心藥理學系，美國伊利諾伊州 芝加哥市 60612)

目的： 觀察孕鼠腹腔脂多糖 (LPS) 注射后母體外周血單個核細胞 (PBMNC) 上Toll樣受體4 (TLR4) 信號通路激活情況和胚胎腦組織中炎癥性細胞因子的水平。方法10.5 d孕鼠腹腔注射LPS 0、3、6、12、24、48 和72 h后，通過蛋白免印跡測定孕鼠PBMNC 上TLR4、分化抗原14 (CD14)、髓樣分化蛋白2 (MD-2)、p65和p50蛋白水平，Luminex 100免疫熒光法測定孕鼠血清、羊水、腦組織及胚胎腦組織細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白水平，實時RT-PCR測定孕鼠PBMNC和胚胎腦組織TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA水平。結(jié)果LPS腹腔注射誘導激活孕鼠PBMNC上TLR4信號通路，TLR4、CD14和MD-2蛋白水平短暫增高，核因子κB (NF-κB) 激活片段p65 和p50蛋白水平增高，TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA水平增高(Plt;0.01)；孕鼠外周血和羊水TNF-α、IL-1β和IL-10水平短暫增高(Plt;0.01)，腦內(nèi)IL-1β蛋白水平短暫升高(Plt;0.01)；胚胎腦內(nèi)TNF-α和IL-1β蛋白和mRNA水平顯著增高(Plt;0.01)。結(jié)論妊娠期母體LPS接觸可激活母體外周免疫細胞TLR4信號通路，引發(fā)胚胎腦內(nèi)炎癥應激狀態(tài)，可能增加出生后相關(guān)疾病的發(fā)生風險。

脂多糖； Toll樣受體4; 細胞因子類； 胚胎

細菌性陰道炎 (bacterial vaginosis,BV) 是妊娠期常見的感染性疾病，大約占妊娠人數(shù)的14％[1]。BV是引起早產(chǎn)、低體重兒和死胎的重要原因[2,3]。BV主要由革蘭陰性菌引起，引起絨毛膜組織腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素1β (interleukin 1β,IL-1β) 和白細胞介素6 (IL-6) 水平明顯增高[4,5]。在BV孕婦羊水中也可以檢測出內(nèi)毒素成分脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)[5]。LPS可誘導胎盤絨毛組織生成炎性細胞因子和前列腺素，與流產(chǎn)和早產(chǎn)有關(guān)[6]。此外，BV與白質(zhì)損傷和腦癱等胎兒的神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生有關(guān)[7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Sprague-Dawley (SD) 大鼠在多巴胺 (dopamine,DA) 能神經(jīng)元發(fā)育早期階段即妊娠期第10.5 d腹腔注射LPS后引起出生后個體DA 能神經(jīng)元數(shù)量減少、紋狀體DA含量降低、腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞活化、炎性細胞因子TNF-α和IL-1β水平升高[8-10]等帕金森病 (Parkinson disease,PD) 特征性的神經(jīng)病理變化，提示妊娠期感染可能是胚胎出生后發(fā)生PD的重要危險因素之一，但是妊娠期母體LPS暴露如何影響胚胎和出生后個體DA系統(tǒng)的功能還不清楚。

LPS是革蘭陰性菌的主要致病成分，具有強烈的免疫激活功能，誘導機體細胞因子失控性表達。Toll樣受體4 (Toll-like receptor 4,TLR4) 是LPS主要識別受體，是介導LPS引發(fā)細胞內(nèi)信號激活不可缺少的細胞表面成分之一[11]。LPS首先與血清的LPS結(jié)合蛋白 (LPS-binding protein,LBP) 結(jié)合，然后再結(jié)合于細胞表面的CD14分子。LPS以LPS-LBP-CD14三體復合物形式活化TLR4信號通路。同時結(jié)合于TLR4胞外區(qū)的髓樣分化因子-2 (myeloid differentiation factor 2,MD-2) 對于穩(wěn)定LPS-LBP-CD14復合物具有重要的作用，是TLR4信號通路中不可缺少的成分之一[12]。TLR4參與的信號轉(zhuǎn)導可以通過核因子 (nuclear factor κB,NF-κB) 激活細胞因子基因轉(zhuǎn)錄，如IL-1、IL-6和IL-8，介導B7家族成員表達活化[13]。

因此本研究觀察孕鼠第10.5 d LPS腹腔注射后孕鼠外周血單個核細胞 (peripheral blood mononuclear cells,PBMNC) TLR4、CD14、MD-2、p65和p50蛋白以及細胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-10 mRNA水平的變化，同時測定孕鼠血清、羊水和腦內(nèi)TNF-α、IL-1β 和IL-10 蛋白以及胚胎腦內(nèi)細胞因子蛋白和mRNA水平，為妊娠期LPS暴露引起出生后個體中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常提供胚胎早期異常的實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1動物的選擇

2 月齡成年SD大鼠購自Zivic-Miller公司。所有的動物飼養(yǎng)在清潔級的動物中心，常規(guī)給于飼料和飲用水，所有的動物在使用前3 d送達，以讓動物適應飼養(yǎng)環(huán)境。所有有關(guān)動物實驗的方案經(jīng)過美國Rush大學實驗動物管理委員會批準。

2SD孕鼠腹腔LPS注射

于妊娠期第10.5 d (embryonic day 10.5,E10.5) 腹腔注射LPS (Sigma,型號：Escherichiacoli026∶B6; 目錄號: L-8274; 10 000 endotoxin units/kg溶于HBSS中) 或HBSS (Hank’s balanced salt solution) 對照，分別于注射后0、3、6、12、24、48和72 h后處死孕鼠，對照組取72 h，每組5只，分別收集孕鼠和胚胎組織，進行下一步的實驗。

3動物的處死和標本的收集

常規(guī)苯巴比妥鈉 (65 mg/kg) 麻醉后打開腹腔，用27G1注射針頭迅速收集羊水，加入肝素抗凝，然后取出胎盤和胚胎組織置于預冷的HBSS中，隨后母體心室內(nèi)抽取5-10 mL全血，肝素抗凝后用于單個核細胞的分離，同時抽取1 mL全血用于分離血清。最后心室內(nèi)灌注預冷的生理鹽水，迅速取出大腦放入干冰預冷的2-甲基丁烷迅速冷凍后置于-80 ℃保存。胚胎斷頭后在解剖顯微鏡下剝離腦膜及血管，分離出的大腦組織用PBS沖洗后，一半置于組織裂解液(Bio-Rad)，另一半置于Trizol液(Invitrogen)中，均用超聲波勻漿儀 (Biologics) 制備勻漿后于-80 ℃下保存不超過2個月。

4PBMNC分離

用Ficoll-Paque Plus淋巴細胞分離液 (Amersham Biosciences) 常規(guī)分離PBMNC，PBS清洗2次制備細胞懸液，分成2份離心去掉上清液，一份加入100 μL組織裂解液，另一份加入200 μL Trizol液，混勻后于-80 ℃下保存。

5孕鼠腦組織的分離

把冷凍的全腦置于干冰預冷的大理石板上，根據(jù)大鼠腦部解剖圖譜，從水平方向切成2 mm厚的薄片，根據(jù)紋狀體和中腦所在部位，用直徑為2 mm的中空組織收集細針收集紋狀體和中腦黑質(zhì)組織，同時收集小腦組織，置于組織裂解液(每10 mg組織至少200 μL裂解液)中，然后用超聲波勻漿儀制備勻漿后低溫12 000×g離心30 min，汲取上清液進行蛋白濃度測定(Bio-Rad)，蛋白濃度表示為g/L。

6PBMNC細胞裂解液Westernblotting測定

細胞裂解液低溫下12 000×g離心15 min后汲取上清液進行蛋白濃度測定后用裂解液稀釋成2 g/L的樣本液，然后加入等體積的上樣緩沖液 (62.5 mmol/L Tris-HCl,pH 6.8,10％ 甘油,2％ SDS,0.1％ 溴酚藍)，熟沸5 min，冷卻后取樣品30 μg以10％ SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，室溫下用封閉液 (含5％脫脂奶粉和1.2％Tween 20)封閉1 h后分別加入用封閉液稀釋的兔抗鼠TLR4 (Santa cruz,1∶500),或CD14 (Santa Cruz,1∶500),或MD-2 (Santa Cruz,1∶500)，或p65和p50 (Santa Cruz,1∶1 000)，或β-actin (Abcam,1∶4 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，用1∶4 000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG(Vector)孵育2 h，再用增強型化學發(fā)光法顯色 (Pierce)，X射線底片 (Fujifilm RX) 曝光。同時選擇β-actin為內(nèi)參照。每次曝光后底片掃描后對條帶的點密度用Scion的軟件進行定量，然后與β-actin作比較，計算出相對百分值。

7細胞因子的測定

細胞因子的測定利用Bio-Rad的多細胞因子分析試劑盒(TNF-α,IL-1β,IL-10)測定，測定方法為Luminex 100免疫熒光法，具體方法可參考文獻[14,15]。這種方法的原理是把不同的抗體連接到特殊的微粒上，然后與標本孵育，這樣抗原與抗體結(jié)合在微粒上后再與生物素標記的抗體孵育后形成抗體-抗原-抗體復合物，最后用鏈親和素標記的Ⅱ抗結(jié)合生物素標記的抗體，結(jié)合流式細胞儀測定微粒的熒光信號，進行定量測定。血清和羊水用分析液進行1∶8稀釋，腦組織提取液用裂解液調(diào)整蛋白濃度到1 g/L后再測定。血清和羊水樣本的細胞因子濃度表示為ng/L，腦組織樣本的濃度表示為ng/g 蛋白，所有標本重復測定，取平均值作為樣本的值。當樣本的熒光強度值低于標準曲線最低值1.95 ng/L時，取1.95 ng/L作為測定值進行分析統(tǒng)計。

8實時定量RT-PCR(real-timeRT-PCR)檢測細胞因子mRNA表達

利用Trizol常規(guī)提取PBMNC和胚胎腦組織總RNA，RNA定量后用DNase (Ambion) 處理樣本去除DNA污染以純化RNA，然后應用一步法real-time RT-PCR檢測TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA的表達水平，并以β-actin為參照，試劑購自Qiagen。引物序列見表1。25 μL的反應體系包括1× RT混合液、0.5 μmol/L的引物和2.5單位的逆轉(zhuǎn)錄酶。反應以SYBR Green為熒光指示劑。反應在50℃下30 min進行逆轉(zhuǎn)錄，95 ℃下15 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，然后94 ℃變性15 s，退火溫度和時間見表1，72 ℃延伸45 s，共30 (β-actin) 或40個循環(huán)。PCR擴增反應的結(jié)果根據(jù)熔解溫度 (Tm) 進行判定。選擇LPS腹腔注射6 h后脾組織的總RNA建立TNF-α、IL-1β、IL-10和β-actin mRNA擴增標準曲線，根據(jù)標準品確定樣本的mRNA相對量，并與內(nèi)參照β-actin對比，計算出樣本內(nèi)不同細胞因子與β-actin的比值。另外在擴增終點取8 μL的產(chǎn)物，進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳并拍照，進一步確定PCR反應的特異性。

表1 實時RT-PCR的引物序列和擴增條件

9統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1孕鼠LPS注射后母體PBMNC上TLR4信號通路的激活

孕鼠PBMNC上表達有TLR4、MD-2和CD14，LPS腹腔注射后以上蛋白組份均短暫增高 (Plt;0.01vs0 h)，見圖1。LPS注射后在3 h-12 h間可見NF-κB激活片段p65和p50表達，提示LPS可快速誘發(fā)免疫細胞內(nèi)TLR4信號通路中NF-κB激活，促進核內(nèi)有關(guān)炎癥性基因的轉(zhuǎn)錄。

2孕鼠LPS注射后母體PBMNC細胞因子mRNA的表達水平

由圖2可見，LPS注射后PBMNC上TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA表達水平明顯增高(Plt;0.01vs0 h)。TNF-α mRNA水平3 h后就達到峰值，48 h后逐漸恢復到正常水平。IL-1β mRNA持續(xù)升高到6 h后逐漸下降，在72 h后仍高于正常值水平，而IL-10 mRNA水平在12 h后明顯上升，但24 h后就逐漸恢復到正常水平。

Figure 1.Maternal lipopolysaccharide (LPS) administration induces a variety of proteins expressed in peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) of gravid rats.±s.n=5.**Plt;0.01 vs control (0 h).

Figure 2.The mRNA levels of TNF-α,IL-1β and IL-10 in PBMNC of gravid rats after maternal LPS administration.±s.n=5.*Plt;0.05,**Plt;0.01 vs control (0 h).

3孕鼠LPS注射后母體血清、羊水和腦內(nèi)細胞因子水平

由表2可見，LPS作用后孕鼠血清TNF-α和IL-1β水平明顯增高 (Plt;0.01vs0 h)。TNF-α在6 h就達到高峰，隨后持續(xù)下降。IL-1β持續(xù)升高到12 h后緩慢下降，72 h仍高于正常水平 (Plt;0.01vs0 h)。此外LPS作用6 h后IL-10水平明顯增高 (Plt;0.01vs0 h)，24 h后迅速下降到正常水平。

同時，E10.5腹腔注射LPS后可見羊水內(nèi)細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-10水平明顯增高 (Plt;0.01vs0 h)。此外孕鼠腦內(nèi)紋狀體、中腦黑質(zhì)和小腦組織內(nèi)只有IL-1β出現(xiàn)水平升高 (結(jié)果未顯示)，24 h后恢復到正常水平。

4孕鼠LPS注射后胚胎腦組織內(nèi)細胞因子水平

E10.5孕鼠腹腔注射LPS后3 h胚胎腦組織內(nèi)TNF-α和IL-1β水平明顯增高 (Plt;0.01vs0 h)，見表3，而IL-10水平?jīng)]有改變。TNF-α和IL-1β 72 h后仍高于對照組水平，提示胚胎腦內(nèi)炎癥性細胞因子水平增高。

5孕鼠LPS注射后胚胎腦組織內(nèi)細胞因子mRNA水平

為進一步驗證腦組織內(nèi)的細胞因子是否來源于胚胎腦組織本身轉(zhuǎn)錄翻譯，我們還測定了腦組織內(nèi)TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA表達水平。由圖3可見，LPS作用后腦內(nèi)TNF-α和IL-1β mRNA表達水平明顯增加 (Plt;0.01vs0 h)。其中TNF-α mRNA 24 h后下降到正常水平，IL-1β在48 h后逐漸下降到正常值水平，而IL-10 mRNA的表達水平?jīng)]有明顯變化。

表2 孕鼠腹腔LPS注射后不同時點血清和羊水細胞因子水平

表3 孕鼠腹腔LPS注射后不同時點胚胎腦內(nèi)細胞因子水平

Figure 3.The mRNA levels of TNF-α,IL-1β and IL-10 in embryonic brains after maternal LPS administration..n=5.**Plt;0.01 vs control (0 h).

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)孕鼠LPS接觸后可通過TLR4信號通路激活母體PBMNC上NF-κB，誘導相關(guān)細胞因子基因轉(zhuǎn)錄，并引起胚胎腦內(nèi)炎癥性細胞因子水平增高。結(jié)合我們前期發(fā)現(xiàn)的E10.5腹腔注射LPS可引起出生后個體DA 能神經(jīng)元數(shù)量減少[8-10]，推測在DA能神經(jīng)元發(fā)育階段，妊娠母體內(nèi)毒素誘發(fā)的胎兒腦內(nèi)炎癥應激，可能會影響胚胎期DA神經(jīng)元系統(tǒng)發(fā)育，最終引起出生后個體DA神經(jīng)元系統(tǒng)功能障礙。

TLR4廣泛表達在各種免疫細胞表面。本研究中，孕鼠腹腔注射LPS后PBMNC TLR4、CD14和MD-2短暫性表達增加，同時LPS誘導NF-κB激活引起p65和p50水平增加。PBMNC內(nèi)TNF-α和IL-1β mRNA表達水平以及血清中有關(guān)細胞因子水平亦明顯升高。PBMNC內(nèi)p65水平升高、細胞因子mRNA表達升高和血清中細胞因子水平升高具有一定的時間次序，提示PBMNC可識別LPS誘發(fā)信號激活NF-κB，隨后引起細胞因子的基因轉(zhuǎn)錄。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)在LPS作用的早期血清中抗炎性細胞因子IL-10亦有升高。IL-10處理后的單核細胞對LPS的反應性明顯下降，提示IL-10在LPS引起的炎癥反應中起對抗作用[16]。LPS引起IL-10水平的升高和IL-10的對抗作用發(fā)生在TNF-α和IL-1β等炎癥性細胞因子水平升高以后[16]。本研究也發(fā)現(xiàn)IL-10蛋白或mRNA水平均較TNF-α和IL-1β反應慢，而且持續(xù)的時間較IL-1β短，提示LPS暴露后IL-10水平增高可能是一種防御性作用，但炎癥性細胞因子占優(yōu)勢，誘導了炎癥損傷。

LPS作用后孕鼠體內(nèi)免疫細胞通過TLR4信號途徑識別LPS和激活信號通路并誘導產(chǎn)生細胞因子，這種作用引起的炎癥性細胞因子是否會影響胚胎的發(fā)育，或是胚胎本身是否能識別LPS從而誘發(fā)自身的免疫反應，目前還不清楚。本研究結(jié)果證實孕鼠LPS接觸會引起胎兒腦內(nèi)炎癥性細胞因子水平升高，這種結(jié)果對于包括DA神經(jīng)元系統(tǒng)在內(nèi)的神經(jīng)組織發(fā)育具有重要的影響作用。在胚胎發(fā)育的早期，由于胎盤屏障和血腦屏障發(fā)育不成熟，母體LPS接觸后產(chǎn)生的細胞因子可能通過血液循環(huán)進入胎盤和胚胎組織引起胚胎腦內(nèi)細胞因子增高，或是妊娠母體LPS直接進入胚胎體內(nèi)。但是此階段胚胎是否識別LPS以及如何激活自身的免疫系統(tǒng)還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)胚胎腦內(nèi)只有炎癥性細胞因子(TNF-α和IL-1β)在蛋白和mRNA水平明顯升高，而IL-10沒有明顯改變，而妊娠母體外周血TNF-α、IL-1β和IL-10水平均明顯增高，提示胚胎腦內(nèi)TNF-α和IL-1β可能來源于胚胎本身對LPS的識別和免疫激活。事實上，TLR4表達在胚胎發(fā)育的早期，小鼠在E10就可在胚盤組織上檢出TLR2和TLR4 mRNA表達，肺和肝臟組織也可在E13檢出TLR2和TLR4 mRNA[17]。我們也發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎腦組織在E10就可以檢測出TLR2和TLR4蛋白表達(資料未顯示)，利用熒光標記的LPS腹腔注射孕鼠后在胚胎體內(nèi)可見熒光物質(zhì)[18]，因此推測在E10.5，妊娠母體LPS暴露后LPS可能會直接通過胎盤組織或血液循環(huán)進入胚胎體內(nèi)，識別TLR4引發(fā)相應的信號激活和基因轉(zhuǎn)錄。

綜上所示，本研究提示妊娠期內(nèi)毒素暴露可誘發(fā)機體通過TLR4信號通路誘導NF-κB激活和炎癥性細胞因子的基因轉(zhuǎn)錄，引發(fā)胚胎炎癥應激狀態(tài)，導致相應窗口期的組織器官發(fā)育異常，增加出生后神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生風險。

[1]Zabor EC,Klebanoff M,Yu K,et al.Association between periodontal disease,bacterial vaginosis,and sexual risk behaviours[J].J Clin Periodontol，2010,37 (10):888-893.

[2]Purwar M,Ughade S,Bhagat B,et al.Bacterial vaginosis in early pregnancy and adverse pregnancy outcome[J].J Obstet Gynaecol Res，2001,27 (4)：175-181.

[3]Denney JM,Culhane JF.Bacterial vaginosis: a problematic infection from both a perinatal and neonatal perspective[J].Semin Fetal Neonatal Med，2009,14 (4)：200-203.

[4]Dammann O,Leviton A.Maternal intrauterine infection,cytokines,and brain damage in the preterm newborn[J].Pediatr Res，1997,42 (1)：1-8.

[5]Romero R,Manogue KR,Mitchell MD,et al.Infection and labor.IV.Cachectin-tumor necrosis factor in the amniotic fluid of women with intraamniotic infection and preterm labor[J].Am J Obstet Gynecol，1989,161 (2)：336-341.

[6]Hillier SL,Witkin SS,Krohn MA,et al.The relationship of amniotic fluid cytokines and preterm delivery,amniotic fluid infection,histologic chorioamnionitis,and chorioamnion infection[J].Obstet Gynecol， 1993,81 (6)：941-948.

[7]Ando M,Takashima S,Mito T.Endotoxin,cerebral blood flow,amino acids and brain damage in young rabbits[J].Brain Dev，1988,10 (6)：365-370.

[8]Carvey PM,Punati A,Newman MB.Progressive dopamine neuron loss in Parkinson’s disease: the multiple hit hypothesis[J].Cell Transplant，2006,15 (3)：239-250.

[9]Ling Z,Gayle DA,Ma SY,et al.In utero bacterial endotoxin exposure causes loss of tyrosine hydroxylase neurons in the postnatal rat midbrain[J].Mov Disord，2002,17 (1)：116-124.

[10]Zhu Y,Carvey PM,Ling Z.Altered glutathione homeostasis in animals prenatally exposed to lipopolysaccharide[J].Neurochem Int，2007,50 (4)：671-680.

[11]王伯瑤，黃 寧，吳 琦.炎癥反應Toll信號傳導通路[J].中國病理生理雜志，2000，16(6)：567-571.

[12]Shimazu R,Akashi S,Ogata H,et al.MD-2,a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4[J].J Exp Med，1999,189 (11)：1777-1782.

[13]Akira S,Takeda K,Kaisho T.Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity[J].Nat Immunol，2001,2 (8)：675-680.

[14]Hulse RE,Kunkler PE,Fedynyshyn JP,et al.Optimization of multiplexed bead-based cytokine immunoassays for rat serum and brain tissue[J].J Neurosci Methods，2004,136 (1)：87-98.

[15]Ling Z,Zhu Y,Tong CW,et al.Prenatal lipopolysaccharide does not accelerate progressive dopamine neuron loss in the rat as a result of normal aging[J].Exp Neurol，2009,216 (2)：312-320.

[16]Grutz G.New insights into the molecular mechanism of interleukin-10-mediated immunosuppression[J].J Leukoc Biol，2005,77 (1)：3-15.

[17]Harju K,Glumoff V,Hallman M.Ontogeny of Toll-like receptors Tlr2 and Tlr4 in mice[J].Pediatr Res，2001,49 (1)：81-83.

[18]Lehnardt S,Massillon L,Follett P,et al.Activation of innate immunity in the CNS triggers neurodegeneration through a Toll-like receptor 4-dependent pathway[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2003,100 (14)：8514-8519.

MaternalexposuretolipopolysaccharideinducesTLR4signalingactivationandembryonicbraininflammatorystressingravidrats

(1DepartmentofNeurology,UnionHospitalofFujianMedicalUniversity,FujianInstituteofGeriatrics,Fuzhou350001,China;2DepartmentofHematology,UnionHospitalofFujianMedicalUniversity,FujianInstituteofHematology,Fuzhou350001,China;3DepartmentofPharmacology,RushUniversityMedicalCenter,Chicago,Illinois60612,USA.E-mail:ygzhu92@gmail.com)

AIM: To observe the signaling activation of Toll-like receptor 4 (TLR4) in peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) of gravid rats and inflammatory cytokine response in embryonic brains following maternal exposure to lipopolysaccharide (LPS).METHODSTimed-pregnant rats at embryonic day 10.5 (E10.5) were intraperitoneally injected with LPS (10 000 endotoxin unit/kg).The PBMNC,serum and amniotic fluid (AF) in gravid rat,and fetal brain were harvested 0 h,3 h,6 h,12 h,24 h,48 h and 72 h after LPS administration.Western blotting was performed to measure the protein levels of TLR4,cluster of differentiation 14 (CD14),myeloid differentiation factor 2 (MD-2),p65 and p50 in PBMNC.Luminex 100 multiplex cytokine assay and real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to determine the protein and mRNA levels of tumor necrosis factor α (TNF-α),interleukin 1β (IL-1β) and interleukin 10 (IL-10).RESULTSMaternal LPS exposure led to TLR4 signaling activation in PBMNC of gravid rats,with a transient (within 6 h) increase in the protein levels of TLR4,CD14 and MD-2,as well as p65 and p50,activated subunits of nuclear factor κB (NF-κB) .Proinflammatory cytokines TNF-α and IL-1β,as well as anti-inflammatory cytokine IL-10,were significantly increased in the serum and AF of gravid rats.There was only a transient increase in IL-1β protein in the brains of gravid rats.In contrast,both protein and mRNA levels of TNF-α and IL-1β were significantly increased in embryonic brains over the time course of 3 h and 48 h.CONCLUSIONThe results reveal that maternal exposure to LPS induces TLR4 signaling activation in peripheral immune cells of gravid rats and inflammatory stress in embryonic brains,indicating the pathogenesis of some postnatal diseases.

Lipopolysaccharide; Toll-like receptor 4; Cytokines; Embryo

1000-4718(2011)05-0956-06

R711; Q189

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.023

2010-11-15

2011-02-22

△ 通訊作者 Tel: 0591-83357896-8525; E-mail: ygzhu92@gmail.com