呂學(xué)維 邵鄰相 張均平 麻艷芳 鄧 剛 徐玲玲 李 美

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，金華 321004)

佛手揮發(fā)油對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞體外增殖的抑制作用

呂學(xué)維 邵鄰相 張均平 麻艷芳 鄧 剛 徐玲玲 李 美

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，金華 321004)

利用水蒸氣蒸餾法提取佛手揮發(fā)油，MTT法測(cè)定細(xì)胞活力;倒置顯微鏡，Hoechst 33342/PI熒光染色及掃描電鏡觀察細(xì)胞凋亡與壞死的形態(tài)變化;彗星電泳法檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷程度。結(jié)果表明:佛手揮發(fā)油能夠顯著抑制B16黑色素瘤細(xì)胞增殖(P＜0.05)，呈劑量依賴(lài)效應(yīng);佛手揮發(fā)油處理B16黑色素瘤細(xì)胞6 h后，倒置顯微鏡下觀察到低、中劑量組(62.5、125、250 μg/mL)細(xì)胞體積縮小，形態(tài)變得不規(guī)則，細(xì)胞碎片增多，部分細(xì)胞成團(tuán)生長(zhǎng)，而高劑量組(500 μg/mL)細(xì)胞膜崩解，胞漿外溢，細(xì)胞碎片增多;熒光顯微鏡下可見(jiàn)低、中劑量組細(xì)胞核固縮，核染色質(zhì)凝集，邊緣化等典型細(xì)胞凋亡特征，而高劑量組細(xì)胞核為PI染成紅色，核染色質(zhì)分布均勻，呈細(xì)胞壞死特征;掃描電鏡觀察到試驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞表面不平整，微絨毛減少等細(xì)胞形態(tài)變化;彗星電泳試驗(yàn)結(jié)果顯示:低、中劑量組細(xì)胞彗星頭逐漸減小，彗尾較長(zhǎng)且近似呈圓形，而高劑量組細(xì)胞彗星頭較大，尾部相對(duì)較短。

佛手 揮發(fā)油 抑制作用 細(xì)胞凋亡 壞死

佛手(fingered citron)，又名佛手柑，為蕓香科植物佛手(Citrus medica L.var.sarcodactylis.Swingle)的成熟果實(shí)。各種蕓香科植物都含有芳香氣味的揮發(fā)油，佛手的揮發(fā)油含量較高，可作為香料植物，應(yīng)用于食品與化妝品中。郭衛(wèi)東等［1］的研究結(jié)果表明佛手鮮果揮發(fā)油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和酵母菌生長(zhǎng)均具有較明顯的抑制作用。Hata T等［2］研究表明，蕓香科柑橘屬植物葡萄柚揮發(fā)油能夠誘導(dǎo)人白血病HL－60細(xì)胞凋亡，其揮發(fā)油主要成分為檸檬烯?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，植物揮發(fā)油具有廣泛的藥理活性，可有效抑制肝癌、子宮頸癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、人白血病細(xì)胞，人卵巢癌細(xì)胞等多種癌細(xì)胞增殖，為一類(lèi)具有開(kāi)發(fā)價(jià)值的抗腫瘤中藥［3－7］。但有關(guān)佛手揮發(fā)油抗腫瘤的研究國(guó)內(nèi)外還鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以金華佛手果揮發(fā)油為受試藥物，其主要化學(xué)成分之一為檸檬烯［8］，以小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞為靶細(xì)胞，研究佛手揮發(fā)油對(duì)B16細(xì)胞增殖的影響，并應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)方法對(duì)佛手揮發(fā)油誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)進(jìn)行初步探討，為佛手資源的開(kāi)發(fā)和利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和藥物

細(xì)胞:小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

佛手揮發(fā)油:金華佛手果實(shí)洗凈后切塊，機(jī)械勻漿，水蒸氣回流裝置提取揮發(fā)油，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾滅菌后稱(chēng)200 mg揮發(fā)油，溶解于20 μL無(wú)菌吐溫－80，渦旋振蕩混勻，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)至2 mL，渦旋振蕩混勻，4℃避光保存。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶:美國(guó)Gibco BRL公司;新生牛血清:杭州四季青生物工程材料公司;二甲基亞砜(DMSO)、四氮唑藍(lán)(MTT)、溴化乙錠(EB)、Hoechst 33342、碘化丙啶(PI)、吐溫 －80:Sigma公司;瓊脂糖:加拿大BBI公司。

3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、1500型全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀:美國(guó)Thermo Electron公司;TS－100型倒置顯微鏡、E600型熒光顯微鏡:日本Nikon公司;AB－104N型電子分析天平:瑞士 Mettler公司產(chǎn)品;KYKY－1000B型掃描電子顯微鏡:中國(guó)中科院科學(xué)儀器廠。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

細(xì)胞采用含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)基(100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)，置于37 ℃含5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，用0.25%的胰酶與0.02%的EDTA(體積比1∶1)消化傳代，取對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

2×103細(xì)胞/孔細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，3×103細(xì)胞/孔細(xì)胞懸液接種于放有蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后加入藥物，使其終濃度為 62.5、125、250、500 μg/mL，空白對(duì)照組加等體積無(wú)血清1640培養(yǎng)基，并設(shè)置0.005%吐溫－80作為對(duì)照，藥物作用6 h后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加MTT溶液10 μL，孵育4 h 后，加入 DMSO 150 μL，振蕩15 min，全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD)值，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。用SPSS13.0軟件求半數(shù)殺傷濃度(IC50)，按下列公式計(jì)算被測(cè)藥物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。

抑制率=(對(duì)照組OD值－試驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%

1.5 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化

藥物作用6 h后，對(duì)照組B16細(xì)胞和佛手揮發(fā)油處理組細(xì)胞直接置于倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.6 Hoechst 33342/PI熒光染色法觀察細(xì)胞核DNA

取出細(xì)胞爬片，加入Hoechst33342染液(5 μg/mL)和PI染液(50 μg/mL)避光染色30 min，紫外光激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7 掃描電鏡觀察細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)

2.5 %的戊二醛固定，PBS清洗后梯度乙醇脫水處理，醋酸異戊酯置換。HCP－2型CO2臨界點(diǎn)干燥儀中干燥處理，SBC－2型離子濺射儀中真空鍍金。KYKY－1000B型掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)變化。

1.8 彗星電泳檢測(cè)細(xì)胞核DNA損傷

主要根據(jù)羅明志等［9］的方法進(jìn)行試驗(yàn)。收集各組細(xì)胞，經(jīng)灌膠、裂解、解旋、電泳、中和、脫水和染色，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)以 x－±s表示，采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 佛手揮發(fā)油對(duì)B16細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，佛手揮發(fā)油對(duì)B16細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，呈良好的量效關(guān)系。IC50值為(138.000±0.005)μg/mL(表1)。

表1 佛手揮發(fā)油對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞活力的影響(x－±s，n=15)

2.2 佛手揮發(fā)油對(duì)B16細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2.1 倒置顯微鏡觀察結(jié)果

倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與0.005%吐溫－80組B16細(xì)胞分布均勻，分裂旺盛，細(xì)胞伸展，多呈梭形或不規(guī)則多角形，貼壁牢固，生長(zhǎng)旺盛(圖1a，圖1b);用終質(zhì)量濃度為 62.5、125、250 μg/mL 的佛手揮發(fā)油處理B16細(xì)胞6 h后，可見(jiàn)隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，細(xì)胞成團(tuán)生長(zhǎng)，部分細(xì)胞體積縮小，形態(tài)變得不規(guī)則，細(xì)胞碎片增多(圖1c～圖1e);500 μg/mL的佛手揮發(fā)油處理組，B16細(xì)胞胞膜完整性破壞，細(xì)胞內(nèi)含物外泄，細(xì)胞已壞死 (圖1f)。

圖1 倒置顯微鏡觀察不同濃度佛手揮發(fā)油作用B16細(xì)胞6 h后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化(×200，Bar=20 μm)

2.2.2 Hoechst 33342/PI熒光染色觀察細(xì)胞核變化Hoechst 33342是一種DNA親和染料，能夠透過(guò)細(xì)胞膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核DNA，使之發(fā)出淡藍(lán)色熒光。PI能透過(guò)細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞，與核DNA結(jié)合，發(fā)橘紅色熒光。在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻的藍(lán)色熒光(圖2 a，圖2b)。不同濃度佛手揮發(fā)油處理B16細(xì)胞6 h后，熒光顯微鏡下觀察，62.5、125、250 μg/mL 佛手揮發(fā)油處理組細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚，邊緣化，核皺縮，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)致密的塊狀或顆粒狀熒光，多數(shù)細(xì)胞核碎裂，表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡特征(圖2c～圖2e)。500 μg/mL佛手揮發(fā)油處理B16細(xì)胞后，細(xì)胞核呈弱紅色熒光，核染色質(zhì)分布均勻，說(shuō)明細(xì)胞已經(jīng)壞死(圖2 f)。

圖2 Hoechst 33342/PI熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化(×250，Bar=40 μm)

2.2.3 掃描電鏡觀察佛手細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)變化

正常對(duì)照組與0.005%吐溫－80組細(xì)胞多數(shù)呈長(zhǎng)梭形，大且飽滿(mǎn)，表面覆有豐富的微絨毛，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛;藥物作用 6 h 后，62.5、125 μg/mL 佛手揮發(fā)油處理組部分細(xì)胞收縮，變圓，細(xì)胞表面不平整，微絨毛減少，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則(圖3 c，圖3d);250 μg/mL佛手揮發(fā)油處理組B16細(xì)胞皺縮為近似圓球形，細(xì)胞膜表面有泡狀突起(圖3e);500 μg/mL佛手揮發(fā)油處理B16細(xì)胞6 h后，細(xì)胞膜崩解，表面微絨毛消失，細(xì)胞內(nèi)含物外泄，細(xì)胞已壞死(圖3f)。

圖3 掃描電鏡觀察佛手揮發(fā)油對(duì)B16細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)的影響(×2 000，Bar=10 μm)

2.3 彗星電泳檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷結(jié)果

彗星電泳，又名單細(xì)胞凝膠電泳，是一種在單細(xì)胞水平上檢測(cè)DNA損傷的微電泳技術(shù)。無(wú)DNA斷裂的細(xì)胞核呈圓形，熒光強(qiáng)度均勻;有DNA損傷的細(xì)胞核在電場(chǎng)作用下DNA碎片向陽(yáng)極遷移，形成“彗星”樣拖尾，DNA損傷越重，碎片越多，彗尾越長(zhǎng)。

圖4 彗星電泳法檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷(×200，Bar=50 μm)

從圖4可以看出，對(duì)照組與0.005%吐溫－80組細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整且著色均勻，無(wú)彗尾形成，說(shuō)明細(xì)胞DNA 未損傷(圖4 a，圖4b);62.5、125、250 μg/mL 佛手揮發(fā)油處理B16細(xì)胞6 h后，受損傷的DNA泳出，形成近似圓形的彗星尾形狀，隨著藥物作用濃度的增加，彗星頭逐漸縮小(圖4 c～圖4e)，說(shuō)明DNA損傷越來(lái)越嚴(yán)重，細(xì)胞已發(fā)生凋亡。500 μg/mL佛手油處理組，細(xì)胞的彗星頭較大，彗尾相對(duì)較短(圖4 f)，細(xì)胞已壞死。團(tuán)生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則;Hoechst 33342/PI染色熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)，低中劑量(62.5、125、250 μg/mL)的佛手揮發(fā)油處理B16細(xì)胞6 h后，細(xì)胞核固縮，核染色質(zhì)凝聚、邊緣化，出現(xiàn)塊狀或顆粒狀熒光，與文獻(xiàn)中報(bào)道的細(xì)胞凋亡特征一致［10］，而高劑量(500 μg/mL)佛手揮發(fā)油處理B16細(xì)胞6 h后，細(xì)胞核為PI染成弱紅色，核染色質(zhì)分布均勻，表現(xiàn)為細(xì)胞壞死特征;掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)低中劑量佛手揮發(fā)油處理組B16細(xì)胞固縮，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面微絨毛減少等特征，以上形態(tài)特征與豆長(zhǎng)明等［11］所描述的細(xì)胞凋亡狀態(tài)一致，而高劑量佛手揮發(fā)油處理組B16細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞壞死特征，如:細(xì)胞膜崩解，胞質(zhì)外泄，細(xì)胞核形態(tài)正常。另外，通過(guò)彗星電泳試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了以上試驗(yàn)結(jié)果。采用不同濃度的佛手揮發(fā)油處理B16細(xì)胞6 h后，彗星電泳結(jié)果顯示，低劑量組B16細(xì)胞形成頭小，尾長(zhǎng)的彗星形態(tài)，而高劑量組B16細(xì)胞彗星頭較大，彗尾較短，與文獻(xiàn)中報(bào)道的典型凋亡與壞死彗星形態(tài)相一致［12］。

綜上所述，佛手揮發(fā)油可有效殺傷體外培養(yǎng)的小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞，低中劑量的佛手揮發(fā)油可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，高劑量的佛手揮發(fā)油可致細(xì)胞壞死。

3 討論與結(jié)論

細(xì)胞凋亡與壞死是細(xì)胞死亡的兩種主要方式，細(xì)胞凋亡時(shí)表現(xiàn)為細(xì)胞萎縮、核染色質(zhì)凝集邊緣化、細(xì)胞膜完整和產(chǎn)生凋亡小體等特征;細(xì)胞壞死時(shí)表現(xiàn)為細(xì)胞膜破損、細(xì)胞核溶解內(nèi)容物外泄、出現(xiàn)細(xì)胞碎片等特征。目前檢測(cè)細(xì)胞凋亡與壞死的方法很多，但形態(tài)學(xué)檢測(cè)仍是確定細(xì)胞凋亡與壞死的最可靠的方法。

本試驗(yàn)采用不同濃度的佛手揮發(fā)油作用小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞，MTT法檢測(cè)佛手揮發(fā)油對(duì)B16細(xì)胞的毒性，結(jié)果表明62.5 μg/mL的佛手揮發(fā)油即可顯著抑制B16細(xì)胞增殖，并隨佛手揮發(fā)油作用濃度的升高，抑制作用增強(qiáng)，存在劑量依賴(lài)效應(yīng)，由此可見(jiàn)，佛手揮發(fā)油在體外對(duì)B16細(xì)胞有直接殺傷作用。倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目逐步減少，成

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Inhibitory Effect of Fingered Citron Essential Oil on Proliferation of B16 Melanoma Cells in Vitro

Lü Xuewei Shao Linxiang Zhang Junping Ma Yanfang Deng Gang Xu Lingling Li Mei
(College of Chemistry and Life Science Zhejiang Normal University，Jinhua 321004)

The essential oil from fingered citron was extracted by steam distillation to determine the cell activity by the MTT method;the inverted microscope and the Hoechst 33342/PI fluorescent staining and scanning electron microscopy were used to observe the morphological changes of apoptosis and putrescence;DNA damage was detected by comet assay.The results showed that the volatile oil of fingered citron could obviously inhibit the cell proliferation of B16 melanoma(P ＜0.05)，which was subject to the dose;after the treatment(6 h)of B16 melanoma with the volatile oil of fingered citron，it was observed under the invested microscope that the cell body of the low －medium dose group(62.5，125 and 250 μg/mL)reduced，the morphological change was irregular，the cell debris increases and some cells grew in bulk，while the high dose group(500 μg/mL)showed morphological changes including ruptured membranes，cytoplasm spillover and increased fragments.With a fluorescence microscope，it could be seen that the low－ medium dose group presented nucleus pycnosis，nuclear chromatin concentration，peripherization and other typical apoptosis characteristics，while the high dose group showed PI tinged red of nucleus，uniform distribution of nuclear chromatin and characteristics of cytoclasis;under the scanning electron microscope，it was observed that t he cellular morphology of the test group was irregular，cell surfaces were uneven，the microvillus reduced and other changes were found in cellular morphology.Moreover，the test results of the comet assay showed that in the low or middle dose groups，comet heads were smaller and comet tails were longer，compared with those in the high dose group.

fingered citron，essential oil，inhibitory effect，apoptosis，necrosis

R285.5

A

1003－0174(2011)08－0050－05

2010－11－05

呂學(xué)維，男，1982年出生，碩士，細(xì)胞生物學(xué)

邵鄰相，男，1962年出生，教授，碩士生導(dǎo)師，細(xì)胞生物學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)