姜?jiǎng)︿h 趙麗芹 陳 濤 何東平

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，呼和浩特 010018)

(湖北百信食品有限公司研發(fā)中心2，武漢 430040)

(中國科學(xué)院武漢病毒研究所3，武漢430071)

(武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院4，武漢 430023)

寇氏隱甲藻不同破壁方法的研究

姜?jiǎng)︿h1，2，4趙麗芹1陳 濤2，3何東平2，4

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，呼和浩特 010018)

(湖北百信食品有限公司研發(fā)中心2，武漢 430040)

(中國科學(xué)院武漢病毒研究所3，武漢430071)

(武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院4，武漢 430023)

寇氏隱甲藻是海洋微藻的一種，在寇氏隱甲藻的細(xì)胞油脂中，二十二碳六烯酸的含量高達(dá)30%～50%。但長期以來，因?yàn)槲⒃宓募?xì)胞壁很難破碎，導(dǎo)致油脂的提取率不高。運(yùn)用超聲波法、生物酶法，反復(fù)凍溶法等方法，對寇氏隱甲藻進(jìn)行了破壁研究。結(jié)果表明，這些方法都對寇氏隱甲藻都具有一定的破壁作用，破壁后油脂的提取率也有了不同程度的提高，把酶法破壁和超聲波法破壁結(jié)合起來，在酶解5 h后，再超聲波1 h，破壁率可高達(dá)91.7%，油脂提取率提高了21.7%，破壁效果更為理想。

寇氏隱甲藻 二十二碳六烯酸 破壁

二十二碳六烯酸(英文名Docosahexaenoic acid，簡稱 DHA，下同)，化學(xué)名稱為二十二碳 －4，7，10，13，16，19 －六烯酸(全順式)，簡記為 C22:6(n －3)，屬n－3系列長鏈多不飽和脂肪酸［1－2］。DHA 是一種功能性脂肪酸，它是人體大腦細(xì)胞的重要組成成分，占大腦脂肪酸的25% ～33%，在胎兒及嬰幼兒大腦和視覺系統(tǒng)發(fā)育過程中占有十分重要的地位，還能有效防止老年癡呆癥，被稱為“高智商因子”、“腦黃金”［3－5］。此外，DHA 還具有加速骨骼增長，防止骨質(zhì)疏松;減少神經(jīng)衰弱及抑郁癥的發(fā)生;降低心肌梗塞、動(dòng)脈硬化、高血壓等心血管疾病發(fā)生的概率的功能;甚至具有抗癌作用，可促進(jìn)成年人外周血液單核細(xì)胞的增殖，提高機(jī)體免疫力，抑制腫瘤細(xì)胞的增生。因此，DHA在嬰幼兒配方乳粉和配方食品、功能性飲料、食用油脂及其它方面都有著廣泛的應(yīng)用［1，6－9］。

目前，DHA的來源主要有2種:深海魚油加工產(chǎn)品和微生物油脂。但由于深海魚油脂肪酸組成復(fù)雜，造成純化工藝復(fù)雜和產(chǎn)品得率低下，且魚油中高的EPA含量和魚腥味也限制了它的應(yīng)用范圍。而通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生的富含DHA的油脂，則較好的解決了上述問題［10］。

寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)是海洋微藻的一種，可在沒有光照的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的增長和油脂的積累。在寇氏隱甲藻藻體中，含油脂高達(dá)30% ～40%，而DHA可占總脂肪酸的30%～50%左右［11］。但長期以來，因?yàn)槲⒃宓募?xì)胞壁很難破碎，油脂難以溶出，導(dǎo)致提取率不高。本試驗(yàn)通過對各種破壁方法的研究，找到了一種較為理想的破壁方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

寇氏隱甲藻:實(shí)驗(yàn)室保藏;培養(yǎng)基:自制;纖維素酶(酶活:10～140萬U/g)、中性蛋白酶(酶活:20萬U/g)、堿性蛋白酶(酶活:20萬U/g)、木瓜蛋白酶(酶活:20萬U/g)和糖化酶(酶活:20萬U/g):南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX－150C型恒溫恒濕箱:上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SW－CJ－1F型凈化工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備有限公司;HYQ－150S型全溫?fù)u床:武漢匯誠生物科技有限公司;TDL－5A型臺(tái)式低速離心機(jī):上海菲恰爾分析儀器有限公司;血球計(jì)數(shù)板:上海市求精生化儀器有限公司;BM100型光學(xué)顯微鏡:南京江南永新光學(xué)有限公司;DF－1型數(shù)顯集熱式磁力攪拌器:常州國華電器有限公司;KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;AUY120型電子天平:島津國際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 寇氏隱甲藻的培養(yǎng)

從平板上取一定量的寇氏隱甲藻藻種于一級(jí)種子培養(yǎng)基，置于搖床上，28℃、150 r/min培養(yǎng)48 h;再按20%的接種量轉(zhuǎn)接到二級(jí)種子培養(yǎng)基，28℃、160 r/min培養(yǎng)48 h;然后按10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26℃、180 r/min培養(yǎng)7 d。離心收集新鮮寇氏隱甲藻藻泥，然后加入一定量的無菌水，制成濃縮液，冷藏備用。

1.3.2 凍溶法

利用溫差破壁是一種常用的破壁方法，它是利用淬冷和急熱過程中產(chǎn)生的沖擊熱應(yīng)力使細(xì)胞壁破裂。在淬冷過程中，細(xì)胞壁的外表面隨著溫度的下降而收縮，但此時(shí)內(nèi)部還是熱的，故細(xì)胞壁收縮受到約束而產(chǎn)生了拉伸應(yīng)力，內(nèi)表面則相反，受壓縮應(yīng)力作用;在升溫解凍時(shí)，細(xì)胞壁外表面由于膨脹受到約束產(chǎn)生壓縮應(yīng)力，而內(nèi)表面則產(chǎn)生拉伸應(yīng)力。這種交變熱應(yīng)力作用最終導(dǎo)致細(xì)胞壁的破裂［12］。

取20 mL濃縮液，置于－18℃冰柜中冷凍24 h，取出后迅速置于80℃的水浴中使之迅速解凍。由于單獨(dú)一次的冷凍和解凍破壁率可能并不高，本試驗(yàn)進(jìn)行一天一個(gè)循環(huán)，測量每次循環(huán)后的破壁率。

1.3.3 超聲波法

取20 mL濃縮液，稀釋至200 mL，超聲時(shí)溫度55℃、功率90%，每20 min計(jì)算1次破壁率。

1.3.4 酶法破壁

1.3.4.1 單一酶處理

取20 mL濃縮液，稀釋至200 mL，分別用纖維素酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、糖化酶，按1%的添加量，在各自最適宜的條件下，進(jìn)行其對微藻破壁效果的研究，每隔1 h計(jì)算破壁率［13］。

1.3.4.2 復(fù)合酶處理

將破壁效果較好的堿性蛋白酶作為主酶，分別以纖維素酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、糖化酶作為輔酶，選擇合適的酶解條件，進(jìn)行復(fù)合酶實(shí)驗(yàn)，用酶總量仍為1%。復(fù)合酶組合如下:A:0.8%堿性蛋白酶+0.2%纖維素酶;B:0.8%堿性蛋白酶+0.2%糖化酶;C:0.8%堿性蛋白酶 +0.2%木瓜蛋白酶;D:0.8%堿性蛋白酶+0.2%中性蛋白酶;E:0.8%堿性蛋白酶+0.1%纖維素酶+0.1%糖化酶;F:0.8%堿性蛋白酶+0.1%中性蛋白酶+0.1%木瓜蛋白酶。具體試驗(yàn)過程參照單一酶的方法。

1.3.5 破壁率的計(jì)算

細(xì)胞計(jì)數(shù)法:利用顯微鏡，通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)算出反應(yīng)前后細(xì)胞數(shù)即可。

破壁率=(1－n/n0)×100%

式中:n為破壁后的細(xì)胞數(shù)，n0為原始細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果與討論

在利用血球計(jì)數(shù)的時(shí)候，觀察到的寇氏隱甲藻細(xì)胞如圖1所示，計(jì)數(shù)時(shí)，諸如形如A類細(xì)胞基本保持完整，記為一個(gè);形如B類細(xì)胞正處于破壁階段，記為半個(gè);形如C類細(xì)胞基本破壁完成，不計(jì)數(shù)。以此標(biāo)準(zhǔn)來計(jì)算破壁率。

圖1 寇氏隱甲藻細(xì)胞圖示

2.1 寇氏隱甲藻培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)活化、一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)后，共得5 L發(fā)酵液;離心收集后的藻泥，加入一定量的無菌水，攪拌使藻體分散，制成1 L濃縮液。鏡檢濃縮液發(fā)現(xiàn)，藻體基本以單個(gè)的形式存在且無破壁現(xiàn)象，符合試驗(yàn)用要求。

2.2 凍溶對寇氏隱甲藻破壁的作用

反復(fù)的凍溶對寇氏隱甲藻的破壁效果如圖2所示。

圖2 反復(fù)凍溶對寇氏隱甲藻破壁率的影響

由圖2可知，隨著反復(fù)凍溶次數(shù)的增加，寇氏隱甲藻的破壁率增大，2次處理后破壁率就達(dá)到高達(dá)50%。盡管反復(fù)凍溶對寇氏隱甲藻的破壁效果較好，但由于在試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)高溫會(huì)引起藻細(xì)胞和藻油的一些變化，且高耗能，生產(chǎn)上應(yīng)用前景不被看好。

2.3 不同種類的酶對寇氏隱甲藻破壁的作用

分別用纖維素酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、糖化酶，對寇氏隱甲藻的破壁效果如圖3所示。

圖3 單一酶對寇氏隱甲藻破壁率的影響

從圖3中可知，在5種酶單獨(dú)使用時(shí)，對寇氏隱甲藻破壁率的影響存在明顯的差異，其中以堿性蛋白酶的破壁效果最好，破壁率高達(dá)80.3%;而纖維素酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、糖化酶破壁率較低，均不超過40%。在試驗(yàn)中，隨著時(shí)間的推移，破壁率會(huì)增大，但在加入堿性蛋白酶約5 h、其他各種酶3 h后，破壁率基本不變。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，考慮到生產(chǎn)成本的因素，如果加入堿性蛋白酶，則酶解時(shí)間5 h為佳。

2.4 復(fù)合酶對寇氏隱甲藻破壁的作用

各種復(fù)合酶組合的處理對寇氏隱甲藻破壁的作用如圖4所示。

圖4 復(fù)合酶對寇氏隱甲藻的破壁率的影響

從圖4中可知，所用復(fù)合酶組合的效果低于單一堿性蛋白酶，原因可能是酶與酶之間存在相互作用，使其活性降低;也可能是不同的酶最適pH、最適溫度等不一樣的緣故。鑒于采用復(fù)合酶法破壁效果較差，不再考慮復(fù)合酶的使用。

2.5 超聲波對寇氏隱甲藻破壁率的影響

超聲波對寇氏隱甲藻的破壁作用如圖5所示。

圖5 超聲波對寇氏隱甲藻破壁率的影響

由圖5可知，超聲波對寇氏隱甲藻的破壁效果較好，時(shí)間短、破壁率較高，2 h后破壁率就接近60%，3 h以后破壁率上升幅度不大。

3 結(jié)論

運(yùn)用凍溶法、超聲波法、單一堿性蛋白酶法和復(fù)合酶法都對寇氏隱甲藻有較好的破壁效果。但由于反復(fù)凍溶法涉及的高溫，可能會(huì)帶來藻體和藻油一些不良的變化，且反復(fù)的淬冷－急熱過程會(huì)消耗大量的能量，生產(chǎn)上不建議使用。酶法破壁條件溫和、耗能少、工藝簡單、易于操作，既可達(dá)到良好的破壁效果，又可以避免高溫和能耗，且不需要額外的設(shè)備，適合工業(yè)化生產(chǎn)，應(yīng)用前途較好。超聲波法時(shí)間較短，有條件的企業(yè)也可以運(yùn)用。另外，把酶法破壁和超聲波法破壁結(jié)合起來，在酶解5 h后，再超聲波1 h，破壁率可高達(dá) 91.7%，油脂提取率提高了21.7%，破壁效果更為理想。

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Study on Different Wall－broken Methods for Crypthecodinium Cohnii

Jiang Jianfeng1，2，4Zhao Liqin1Chen Tao2，3He Dongping2，4
(College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agricultural University1，Hohhot010018)
(Investigation Center，Hubei Pashun Foods Co.，Ltd.2，Wuhan 430040)
(Wuhan Institute of Virology，Chinese Academy of Science3，Wuhan 430071)
(College of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University4，Wuhan 430023)

Crypthecodinium cohnii is a marine microalgae，and the DHA contents are as high as 30%to 50%in the Crypthecodinium cohnii cell oils.But for a long range，oil extraction rate was unsatisfactory since cell walls were hard to break.The breaking of cell wall of Crypthecodinium cohnii by supersonic treatment，enzymatic procession and temperature－difference was evaluated separately in the article.The results showed that all methods were effective to the wall－ broken efficiency and oil extraction rate.The better results could be obtained if we combined the enzymatic procession(for 5 h，first)and the supersonic treatment(for 1 h，then)，as the rate of wall broken could be up to 91.7%and the oil extraction rate increased 21.7%.

Crypthecodinium cohnii，Docosahexaenoic acid(DHA)，Wall－ breaking

Q178.53

A

1003－0174(2011)08－0092－04

2010－10－28

姜?jiǎng)︿h，男，1985年出生，碩士，農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程

何東平，男，1957年出生，教授，博士生導(dǎo)師，微生物油脂與植物蛋白