談佳玉 王承明

(華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，武漢 430070)

響應(yīng)面法優(yōu)化酶法制備花生蛋白的工藝研究

談佳玉 王承明

(華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，武漢 430070)

以花生粕為原料，對在乙醇水溶液中利用α－淀粉酶制備花生蛋白的工藝條件進行了研究。探討乙醇體積分數(shù)、加酶量、pH、酶解溫度、酶解時間、液料比6個因素對可溶性總糖提取率的影響，試驗表明乙醇體積分數(shù)、酶解時間、pH和液料比對提取過程影響較大。通過Box－Behnken中心組合試驗和響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化工藝條件:pH 5.95、酶解時間52 min、液料比13.8∶1、乙醇體積分數(shù)76%、加酶量0.5%、酶解溫度35℃，總糖提取率為13.06%。對此工藝條件進行驗證得到蛋白質(zhì)純度為70.29%，而單純的乙醇溶液提取法蛋白質(zhì)純度為62.03%。

花生濃縮蛋白 α－淀粉酶 響應(yīng)曲面法

花生是全球最重要的四大油料作物之一［1］，我國是全球最大的花生生產(chǎn)國，產(chǎn)量穩(wěn)定在1 500萬t左右。在我國花生除直接食用外，主要用于榨油，每年在榨油后能得到超過900萬t的花生粕［2］?；ㄉ蔂I養(yǎng)價值較高，通常含有40% ～50%的蛋白質(zhì)。花生粕的花生蛋白是一種很好的植物蛋白，它含有人體所需的8種必須氨基酸，且易為人體消化吸收，并含有比大豆蛋白更少的抗營養(yǎng)因子［3］，花生蛋白在食品中具有廣泛的應(yīng)用。

花生粕除了含有豐富的蛋白質(zhì)，還含有較多的碳水化合物，在花生蛋白的制備過程中加入淀粉酶，可以降解花生粕中的碳水化合物，有利于花生多糖的浸出，從而提高花生蛋白的純度。常用糖的提取劑有水、乙醇水溶液，本試驗選擇乙醇水溶液作為提取劑，可以減少花生粕中水溶性蛋白的流失，提高了花生蛋白的純度。

試驗以脫殼高溫榨油后的花生粕為原料，采用以乙醇水溶液為提取劑，α－淀粉酶輔助制備花生蛋白。以總糖提取率為指標，利用單因素試驗和響應(yīng)曲面設(shè)計法分析不同因素對總糖提取效果的影響，并對提取工藝進行了條件優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生粕由山東龍大集團公司提供，粉碎后過60目篩，石油醚回流，95%乙醇回流，晾干備用。

α－淀粉酶(生化試劑BR):酶活性≥30 000 U/g，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。

葡萄糖、濃硫酸、苯酚、考馬斯亮藍、無水乙醇等:國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平、320－S pH計:梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;TDL－5A型離心機:上海菲恰爾分析儀器有限公司;722型可見分光光度計:津普瑞斯儀器有限公司;恒溫水浴鍋:金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料成分測定

脂肪含量的測定:索氏抽提法(GB/T 6432—1994);蛋白質(zhì)含量的測定:微量凱氏定氮法(GB/T 5009.5—1985)(氮對蛋白的轉(zhuǎn)換系數(shù)為5.46);灰分含量的測定:灼燒法(GB/T 14770—1993);水分含量的測定:恒重法(GB/T 5009.3—2003);總糖含量的測定:苯酚 － 硫酸法［4］。

1.3.2 花生濃縮蛋白的制備工藝

稱取適量已處理過的原料于三角瓶中，加入一定比例、一定體積分數(shù)的乙醇，調(diào)節(jié)至一定的pH值，按一定比例添加α－淀粉酶，恒溫水浴，然后沸水滅酶5 min，室溫下離心10 min(4 000 r/min)，將濾液定容后測定總糖含量和可溶性蛋白的含量。

1.3.3 總糖含量的測定及標曲繪制

總糖含量的測定，苯酚－硫酸法［5］，得可溶性糖的標準曲線，其回歸方程為:Y=7.12x－0.035 1(r=0.999 8)。

總糖提取率=總糖含量/花生粕干質(zhì)量×100%

1.3.4 可溶性蛋白含量的測定及標曲繪制

可溶性蛋白質(zhì)的測定，考馬斯亮藍G－250染色法［6］，得可溶性蛋白質(zhì)的標準曲線，其回歸方程為:Y=5.225x －0.006 1(r=0.999 9)。

蛋白質(zhì)提取率=蛋白質(zhì)溶出量/花生粕干質(zhì)量×100%

1.3.5 單因素試驗

以濾液中的總糖含量和可溶性蛋白含量為評價指標，研究不同乙醇體積分數(shù)、液料比、加酶量、酶解時間、酶解溫度及pH對制備花生濃縮蛋白的主要影響。

1.3.6 響應(yīng)曲面的組合試驗

根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，利用Design－Expert 7軟件進行Box－Behnken中心組合試驗設(shè)計，優(yōu)化花生濃縮蛋白的制備工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 花生粕的主要成分

從表1可以看出花生粕中的主要成分是蛋白質(zhì)和糖類，其中蛋白質(zhì)含量較高，約占50%。

表1 花生粕的主要成分

2.2 酶法制備花生濃縮蛋白的單因素分析

2.2.1 酶解溫度對總糖提取率和蛋白質(zhì)溶出率的影響

固定乙醇體積分數(shù)80%，液料比20∶1，加酶量為0.5%，pH 6.0，酶解時間 60 min，酶解溫度分別設(shè)定為30、35、40、45、50、55 ℃，結(jié)果見圖 1。由圖 1 可以看出總糖提取率在35℃時達到最高，隨著溫度的升高總糖提取率緩慢下降，這與在酶在有機溶劑中熱穩(wěn)定性大大提高有關(guān)［7］。當溫度升高到55℃時，總糖提取率急劇下降，這主要是因為當反應(yīng)溫度超過酶的最適溫度時，酶容易發(fā)生變性而鈍化，使得酶解反應(yīng)速度降低。隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)溶出率無多大變化，說明溫度對蛋白質(zhì)溶出率的影響很小。所以，選擇酶解溫度為35℃。

圖1 酶解溫度對總糖提取率和蛋白質(zhì)溶出率的影響

2.2.2 pH對總糖提取率和蛋白質(zhì)溶出率的影響

固定乙醇體積分數(shù)80%，液料比20∶1，加酶量為0.5%，酶解溫度為40℃，酶解時間60 min，pH值分別設(shè)定為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，結(jié)果見圖 2。

酶的催化能力與pH有較大的關(guān)系，由圖2可以看出，當pH 6.0時總糖提取率最高，pH 7.5時總糖提取率下降較多。隨著pH的升高，蛋白質(zhì)溶出率緩慢增加，符合蛋白質(zhì)的堿溶性。在pH 6.0時，總糖提取率最高而蛋白質(zhì)溶出率較低，故選擇pH 6.0為宜。

圖2 pH對總糖提取率和蛋白質(zhì)溶出率的影響

2.2.3 加酶量對總糖提取率和蛋白質(zhì)溶出率的影響

固定乙醇體積分數(shù)80%，液料比20∶1，pH 6.0，酶解溫度為40℃，酶解時間60 min，加酶量分別設(shè)定為 0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%，結(jié)果見圖3。

酶的添加量直接反應(yīng)酶促反應(yīng)的速度。由圖3可以看出隨著加酶量的增加，提取率逐漸提高，加酶量為0.5%時，總糖提取率最高，之后，提取率逐漸下降。這主要是因為淀粉酶在水解過程中水解產(chǎn)物對酶有一定的抑制作用［8］。當產(chǎn)物濃度不斷增加，抑制作用增大，使得酶活性下降，所以上清液中可溶性總糖的含量減少。在加酶量為0.5%時，總糖提取率較高而蛋白質(zhì)溶出率較低。

圖3 加酶量對總糖提取率和蛋白質(zhì)溶出率的影響

2.2.4 酶解時間對總糖提取率和蛋白質(zhì)溶出率的影響

固定乙醇體積分數(shù)80%，液料比20∶1，pH 6.0，酶解溫度為40℃，加酶量0.5%，酶解時間分別設(shè)定為 30、45、60、75、90、105 min，其結(jié)果見圖 4。

由圖4可以看出，隨著酶解時間的延長，總糖提取率逐漸上升，60 min時達到最大。酶解60 min后總糖提取率下降，主要原因是酶的活力隨時間的延長而相對下降。

圖4 酶解時間對總糖提取率和蛋白質(zhì)溶出率的影響

2.2.5 液料比對總糖提取率和蛋白質(zhì)溶出率的影響

固定乙醇體積分數(shù)80%，pH 6.0，酶解溫度為40℃，加酶量0.5%，酶解時間60 min，液料比分別設(shè)定為 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1，其結(jié)果見圖5。

液料比直接影響酶與底物相互作用幾率的大小。小的液料比有利于酶與底物的相互接觸，但是液料比小，溶液的黏度就大，影響傳質(zhì)過程的進行［9］。圖5表明隨著液料比的增大，總糖提取率逐漸增加，在液料比為15∶1時達到最大值，而后提取率緩慢下降，主要因為反應(yīng)體系中水分較多時，酶的濃度會相應(yīng)下降，糖的浸出速率也隨之下降。蛋白質(zhì)溶出率隨著液料比的增加而緩慢下降。故選取液料比15∶1為宜。

圖5 液料比對總糖提取率和蛋白質(zhì)溶出率的影響

2.2.6 乙醇體積分數(shù)對總糖提取率和蛋白質(zhì)溶出率的影響

固定pH 6.0，酶解溫度為40℃，加酶量0.5%，酶解時間60 min，液料比20∶1，乙醇體積分數(shù)分別設(shè)定為60%、70%、80%、90%、100%，其結(jié)果見圖6。

酶在完全無水的溶劑中通常沒有活性，只有吸收一定水分酶才能表現(xiàn)其活性，所以體系中的水分對酶的催化反應(yīng)有著重要的影響。圖6表明隨著乙醇體積分數(shù)不斷降低，體系含水量增加時，總糖提取率也不斷增加。酶活性只取決于被酶分子吸收的水分而與溶劑的水含量無關(guān)［10］。當乙醇體積分數(shù)達到80%后繼續(xù)降低時，上清液中的總糖含量只是緩慢增加。蛋白溶出率隨著乙醇體積分數(shù)的增加急劇下降。綜合考慮總糖提取率和蛋白質(zhì)溶出率，選取乙醇體積分數(shù)為80%為宜。

圖6 乙醇體積分數(shù)對總糖提取率和蛋白質(zhì)溶出率的影響

2.3 響應(yīng)曲面的試驗設(shè)計與結(jié)果分析

2.3.1 試驗設(shè)計方案與結(jié)果分析

根據(jù)單因素分析結(jié)果，加酶量與酶解溫度對總糖提取率的影響不是很顯著，因此選擇加酶量為0.5%，酶解溫度為35℃。選取乙醇體積分數(shù)、pH、液料比、酶解時間對總糖提取率的影響較顯著的4個因素，進行4因素3水平的Box－Behnken中心組合試驗設(shè)計，試驗因素和水平見表2，試驗設(shè)計及多糖提取率結(jié)果見表3。

表2 試驗因素和水平

表3 Box－Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果

利用Design－Expert軟件對表3中的試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到總糖提取率對以上4個因素的回歸方程為:

總糖提取率 Y=12.823 33－0.748 333X1－0.199 167X2－0.293 333X3－0.502 5X4－1.289 583 X1X1+0.002 5X1X2+0.165X1X3+0.202 5X1X4－1.053 333 X2X2－ 0.097 5X2X3+0.042 5X2X4－0.904 583X3X3+0.192 5X3X4－0.598 333X4X4

對回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 回歸模型方差分析

由表4可知，回歸模型極顯著(P＜0.01)。模型一次項X1、X4極顯著，X3顯著，X2不顯著，且顯著順序是X1(乙醇體積分數(shù))＞X4(酶解時間)＞X3(液料比)＞X2(pH);二次項均極顯著，表明各具體試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。各試驗因子與響應(yīng)值的關(guān)系中，其因變量和全體自變量之間的相關(guān)系數(shù) R=23.594 98/25.737 85 ×100%=91.67%，說明總糖提取率變化有91.67% 來源于所選的變量(乙醇體積分數(shù)、pH、液料比和酶解時間)，且還存在其他的干擾因素。整體分析來看，回歸模型的擬合程度較好，可以用上述回歸方程對α－淀粉酶制備花生濃縮蛋白的試驗結(jié)果進行分析預測和確定最佳提取工藝條件。

2.3.2 最佳提取工藝條件的確定

為進一步確定個因素的最優(yōu)條件，對回歸方程取一階偏導數(shù)等于零解方程組得X1=－0.346 78，X2= －0.094 17，X3= －0.244 15，X4= －0.521 22，即α－淀粉酶制備花生濃縮蛋白最優(yōu)條件為乙醇體積分數(shù) 76.53%，pH 5.952，液料比 13.779∶1，酶解時間52.181 min。在此條件下總糖提取率的預測值為13.12%。

2.3.3 回歸模型的驗證試驗

考慮到實際操作的情況，將最優(yōu)條件修正為:乙醇體積分數(shù) 76%，pH 5.95，液料比 13.8∶1，酶解時間52 min，在此條件下重復3次，測得總糖提取率分別為 12.93%、13.07%、13.17%，總糖提取率試驗值為13.06%，與預測值相比，其誤差為0.46%。因此采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳條件可靠。

2.3.4 酶為介質(zhì)乙醇溶液提取法與乙醇溶液提取法的比較

以花生粕為原料，在上述酶法優(yōu)選工藝條件下，得到的花生蛋白純度為70.29%，而以不加酶直接用乙醇水溶液提取得到的花生蛋白純度為62.03%。表明α－淀粉酶在高體積分數(shù)的乙醇水溶液中也具有一定的活性，能降解淀粉，提高了糖類物質(zhì)的浸出率，從而提高了花生蛋白的純度。

3 結(jié)論

在醇法制備花生蛋白的基礎(chǔ)上，本試驗提出一種酶處理和乙醇提取同時進行的方法制備花生蛋白。試驗表明，以酶為介質(zhì)乙醇溶液制備花生蛋白受到多種因素的影響，包括乙醇體積分數(shù)、加酶量、酶解溫度、酶解時間、pH、液料比等，其中乙醇體積分數(shù)、酶解時間、pH、液料比的影響較為顯著。通過響應(yīng)面法分析優(yōu)化，得到最佳的工藝條件是:加酶量0.5%、pH 5.95、酶解溫度35 ℃、酶解時間52 min、液料比13.8∶1、乙醇體積分數(shù)76%。此條件下，總糖提取率為13.06%，蛋白質(zhì)純度為70.29%。與醇法提取相比，本試驗制備花生濃縮蛋白的條件更加溫和，與水酶法制取相比，由于選擇乙醇水溶液作為提取劑，不僅減少了花生蛋白的流失，而且使部分色素溶出，得到的花生濃縮蛋白純度高且色澤好。

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Study on Optimized Enzyme－assisted Preparation Process of Peanut Protein by Response Surface Methodology

Tan Jiayu Wang Chengming
(College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070)

Preparation of peanut protein by α － amylase in the ethanol aqueous was studied.The effects of ethanol concentration，amylase amount，pH，temperature，time and ratio of liquid to material on extraction yield of total soluble sugar were explored.The result showed that ethanol concentration，extraction time，pH and ratio of liquid had great influence on the extraction process.The extraction process conditions were optimized by Box－Behnken centerunited experiment design and response surface methodology，and the result indicated that the optimum extraction conditions were ethanol concentration 76%，pH value 5.95，extraction time 52 min，ratio of liquid to material 13.8∶1，amylase amount 0.5%and extraction temperature 35 ℃，and the extraction yield of total soluble sugar was 13.06%.Under the optimized conditions the purity of peanut protein was 70.29%，and the purity of peanut protein was 62.03%without adding α － amylase.

peanut protein concentrate，α － amylase，response surface methodology

A

1003－0174(2011)08－0100－05

2010－09－26

談佳玉，女，1983年出生，碩士，天然產(chǎn)物

王承明，男，1964年出生，教授，農(nóng)業(yè)資源利用和食品安全