張海峰 秦金丹 周?chē)?guó)雄 丁曉凌 黃介飛

5-脂氧合酶基因沉默后裸鼠胰腺癌移植瘤相關(guān)基因的變化

張海峰 秦金丹 周?chē)?guó)雄 丁曉凌 黃介飛

目前認(rèn)為，5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)代謝途徑異常是促進(jìn)多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一。其機(jī)制為促進(jìn)細(xì)胞過(guò)度增殖、抑制凋亡；促進(jìn)惡性腫瘤血管生成；提高惡性腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的潛能、增加腫瘤細(xì)胞的侵襲力；抑制5-LOX能使多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖減低并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[1]。

本實(shí)驗(yàn)利用基因芯片檢測(cè)靶向5-LOX的shRNA真核表達(dá)載體導(dǎo)入SW1990細(xì)胞形成的裸鼠皮下移植瘤內(nèi)并聯(lián)合雷公藤內(nèi)酯醇(TL)治療后移植瘤組織基因表達(dá)譜的變化，探討沉默5-LOX基因表達(dá)治療胰腺癌的應(yīng)用價(jià)值。

一、材料與方法

1．裸鼠移植瘤模型制作及分組：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW1990細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×108個(gè)/ml，分裝于1 ml的無(wú)菌EP管中備用。18只BALB/cnu/nu裸鼠購(gòu)自解放軍南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，在SPF級(jí)屏障環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)。取0.1 ml混勻的細(xì)胞懸液，注入每只裸鼠右側(cè)腋下。待移植瘤長(zhǎng)至100 mm3左右(約10 d)按數(shù)字表法隨機(jī)分為靶向5-LOX的shRNA組、shRNA+TL組和對(duì)照組，每組6只。shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-ALOX5-1021由上海吉瑪公司構(gòu)建，正義鏈5′-CACCGCTCCCATCTGCTTGCTGTATTTCAAGAGAATACAGCA-AGCAGATGGGAGCTTTTTTG-3′；反義鏈5′-GATCCAAAA-AAGCTCCCATCTGCTTGCTGTATTCTCTTGAAATACAGCAAG-CAGATGGGAGC-3′。shRNA瘤內(nèi)注射量為50 μg/只(0.1 ml)，3 d一次，共7次；TL腹腔內(nèi)注射劑量為0.25 mg/kg體重(0.2 ml)，每天一次，共19 d。第30天處死動(dòng)物，取腫瘤組織，稱(chēng)瘤重。取部分瘤組織，置-80℃冰箱保存。

2．移植瘤基因表達(dá)譜的檢測(cè)：采用Trizol試劑抽提移植瘤組織總RNA，采用 Cy5熒光標(biāo)記，應(yīng)用基因表達(dá)譜寡核苷酸芯片(31118個(gè)基因，上海生物芯片公司)進(jìn)行雜交，雜交條件：50℃ 16 h后 42℃洗片。芯片結(jié)果應(yīng)用 Agilent掃描儀掃描，采用 Genespring行 Normalize分析，處理組/對(duì)照組比值≥2為上調(diào)基因，≤0.5為下調(diào)基因。

3．RT-PCR驗(yàn)證血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)：采用RT-PCR方法檢測(cè)。VEGF引物序列：上游5′-GGGCCT-CCGAAACCATGAACTT-3′，下游5′-TCGCATCAGGGGCAC-ACAG-3′， 擴(kuò)增片段260 bp；內(nèi)參β-actin引物序列：上游5′-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3′，下游5′-ATGCATTCACCT-CCCCTGTG-3′擴(kuò)增片段486 bp。引物由上海invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min， 94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 40 s，30次循環(huán)，72℃延伸7 min。

二、結(jié)果

1．一般情況：注射SW1990細(xì)胞懸液后裸鼠生長(zhǎng)狀況良好，飲食以及活動(dòng)正常，未出現(xiàn)驚恐、不安、拒食等情況。各組裸鼠治療前后的體重的改變無(wú)明顯差異(表1)。

2．裸鼠腫瘤生長(zhǎng)情況：治療組腫瘤的生長(zhǎng)速度減慢，移植瘤體積均小于同時(shí)點(diǎn)的對(duì)照組。第30天對(duì)照組平均瘤體積是用藥前的7.01倍；shRNA組是用藥前的3.11倍；shRNA+TL組是用藥前的1.97倍(圖1)。兩治療組的瘤重均較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，抑瘤率均達(dá)50%以上，但兩治療組間無(wú)顯著差異(表1)。

圖1注射SW1990細(xì)胞4周時(shí)shRNA+TL組(a)、shRNA組(b)和對(duì)照組(c)裸鼠的移植瘤生長(zhǎng)情況

表1 各組裸鼠體重、移植瘤重及抑瘤率

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05

3．差異表達(dá)基因：shRNA組上調(diào)基因401條，下調(diào)基因751條；shRNA +TL組上調(diào)基因760條，下調(diào)基因1254條。兩組共同下調(diào)的基因主要包括G蛋白耦聯(lián)受體基因、代謝相關(guān)基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因、細(xì)胞黏附相關(guān)基因及生長(zhǎng)因子基因等，其中有VEGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞核因子、脂氧合酶同源性序列、表皮生長(zhǎng)因子、NFkB 活化蛋白、血小板衍生生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄激活因子等(圖2)。經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證，兩治療組VEGF mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯減弱(圖3)。

圖3 各組移植瘤組織VEGF表達(dá)(RT-PCR)

討論眾多研究證實(shí)，胰腺癌組織中5-LOX mRNA及蛋白表達(dá)明顯增高，而正常胰腺組織中未見(jiàn)表達(dá)。抑制5-LOX的表達(dá)可導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞增殖抑制、凋亡增加[2-3]。我們先前的研究表明，5-LOX抑制劑齊留通、雷公藤內(nèi)酯醇等處理胰腺癌SW 1990細(xì)胞后，細(xì)胞5-LOX mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降，凋亡增加；同時(shí)VEGF表達(dá)下調(diào)；應(yīng)用靶向5-LOX的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體同樣可有效阻斷SW1990細(xì)胞5-LOX基因表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡[4-8]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用靶向5-LOX的shRNA載體瘤內(nèi)注射加或不加雷公藤內(nèi)酯醇注射制劑腹腔內(nèi)注射的方法治療裸鼠皮下移植瘤，兩治療組的抑瘤率均超過(guò)50%，但兩種治療方法的療效無(wú)顯著差異，無(wú)聯(lián)合治療的必要。通過(guò)基因芯片檢測(cè)，兩組共同下調(diào)的基因主要包括G蛋白結(jié)合受體基因、代謝相關(guān)基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因、細(xì)胞黏附相關(guān)基因及生長(zhǎng)因子基因等，提示5-LOX代謝通路可以通過(guò)多條途徑影響生長(zhǎng)因子基因的表達(dá)從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化，抑制腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移。

[1] 李勇，李建英，王小眾.5-脂氧合酶促癌機(jī)制研究進(jìn)展.世界華人消化雜志，2006，14：800-804.

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2010-10-15)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.023

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