張?zhí)m濤，常翠青，劉 陽，陳志民

北京大學(xué) 第三醫(yī)院運動醫(yī)學(xué)研究所，北京 100191

·減重、糖尿病手術(shù)及綜合治療論壇論著·

氯原酸對db/db小鼠糖脂代謝紊亂的影響及其作用機制

張?zhí)m濤，常翠青，劉 陽，陳志民

北京大學(xué) 第三醫(yī)院運動醫(yī)學(xué)研究所，北京 100191

目的研究氯原酸(CGA)對自發(fā)性肥胖糖尿病db/db小鼠糖脂代謝紊亂的影響及其作用機制。方法將13只5～6周齡雄性db/db小鼠隨機分為db/db-CGA組(n=7)和db/db-CON組(n=6)，13只5～6周齡雄性db/m小鼠隨機分為db/m-CGA組(n=6)和db/m-CON組(n=7)；CGA組均給予80 mg/(kg·d)CGA灌胃，CON組均給予等體積PBS灌胃。12周后檢測血漿、肝臟、骨骼肌中糖脂生化指標(biāo)，內(nèi)臟脂肪組織中脂聯(lián)素和內(nèi)脂素含量，肝臟葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)和過氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPAR-α)的mRNA水平及其蛋白表達。結(jié)果給予CGA 12周后，db/db-CGA組小鼠血漿、肝臟和骨骼肌中三酰甘油含量和空腹血糖均明顯低于db/db-CON組(P均<0.05)，肌糖原含量明顯高于db/db-CON組(P<0.05)；脂聯(lián)素水平明顯高于db/db-CON組(P<0.01)，低于db/m-CGA組(P<0.05)；內(nèi)脂素水平明顯低于db/db-CON組(P<0.01)，高于db/m-CGA組(P<0.05)；G-6-Pase mRNA表達水平較db/db-CON組明顯下降(P<0.05)， PPAR-α mRNA和蛋白表達水平均較db/db-CON組明顯升高(P<0.05)。結(jié)論CGA可改善自發(fā)性肥胖糖尿病小鼠糖脂代謝紊亂，其機理可能與調(diào)節(jié)脂肪因子分泌，上調(diào)肝臟PPAR-α水平及抑制G-6-Pase表達有關(guān)。

氯原酸；糖脂代謝；脂聯(lián)素；內(nèi)脂素；db/db小鼠

氯原酸(chlorogenic acid，CGA)是一種由咖啡酸與奎尼酸縮合而成的酚酸，廣泛存在于植物性食物和咖啡飲品中，也是中草藥金銀花的主要功效成分。近年研究顯示，CGA可以顯著改善糖、脂代謝紊亂，提高胰島素敏感性[1-5]，提示CGA對2型糖尿病的預(yù)防和治療具有重要作用。db/db小鼠是一種自發(fā)性肥胖糖尿病模型，其與人類2型糖尿病發(fā)病過程相似，因此廣泛用于糖尿病的實驗研究。本研究采用db/db小鼠，觀察了CGA對自發(fā)性肥胖糖尿病小鼠糖脂代謝紊亂的影響，探討了CGA防治糖尿病的作用和機理，以期為防治糖尿病提供新的科學(xué)依據(jù)。

材料和方法

材料CGA：綠色咖啡豆提取物(純度99%，美國Acros公司)，采用PBS(pH 7.4)配制成20 mg/ml的CGA溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)和三酰甘油(triglyceride，TG)試劑盒購自北方中控科技股份有限公司，游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，肌糖原及肝糖原試劑盒購自南京建成生物工程研究所，胰島素、脂聯(lián)素、內(nèi)脂素酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自美國RB公司，RNA提取試劑盒購自北京博大泰克生物公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR) 試劑盒購自北京天根生物公司；過氧化物酶體增殖物激活受體-α(peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPAR-α)兔抗鼠多克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔抗鼠多克隆抗體購自美國Bioworld公司，羊抗兔熒光二抗購自美國LI-COR公司。

實驗動物及分組5～6周齡雄性C57BL/BKS db/db小鼠13只，體重20～25 g，隨機分為db/db-CGA組(n=7)和db/db-CON組(n=6)。5～6周齡雄性db/m小鼠13只，體重15～20 g，隨機分為db/m-CGA組(n=6)和db/m-CON組(n=7)。實驗動物均購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部，所有CGA組均給予CGA 80 mg/(kg·d)灌胃，CON組則給予等體積PBS灌胃，實驗期間連續(xù)監(jiān)測進食量，每10 d監(jiān)測小鼠體重。干預(yù)12周，禁食12 h后處死，摘眼球取血，分離血漿。脫頸椎后取腎臟和睪丸周圍脂肪組織、肝臟、骨骼肌放入液氮保存。

生化指標(biāo)檢測采用酶比色法檢測FPG、TC和TG，改良銅試劑比色法檢測FFA，比色法檢測肌糖原和肝糖原，酶標(biāo)法檢測血清胰島素和脂肪組織脂聯(lián)素、內(nèi)脂素，氯仿勻漿法處理肝和肌肉組織后，酶比色法測定肝臟及骨骼肌TG[6]。

肝臟葡萄糖-6-磷酸酶和PPAR-αmRNA表達檢測采用Trizol試劑盒提取肝臟總RNA。cDNA合成：取總RNA 2 μg，Oligo(dT)2 μl，dNTP 2 μl，用ddH2O定容至14.5 μl；70℃加熱5 min后迅速冰上冷卻2 min，加入RNasin 0.5 μl，5×First-Strand Buffer 4 μl，TIANScriptM-MLV 1 μl，用ddH2O使總體積達20 μl。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃ 50 min，95℃ 5 min，所得產(chǎn)物用于PCR擴增。引物序列如下：(1)肝臟葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G-6-Pase)上游：5’-TCCTGGGACAGACACACAAG-3’，下游：5’-CAACTTT- AATATACGCTATTGG-3’；(2)PPAR-α上游：5’-ATGTCCGTGGAGACCGTCAC-3’，下游：5’-GGTTCTTAA- GGAACTCGCGTG- 3’；(3)GAPDH上游：5’-AGGCCGGTGCTGAGTATGTC-3’，下游：5’-TGCCTGTTCACCACCTTCT-3’。PCR擴增：取cDNA 2 μg，ddH2O 9.5 μl， PCR Mastermix 12.5 μl，上、下游引物各0.5 μl，用ddH2O定容至25 μl。PCR反應(yīng)條件：(1)G-6-Pase: 94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，共35個循環(huán)；72℃ 10 min。(2)PPAR-α：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，共35個循環(huán)；72℃ 10 min。取5 μl反應(yīng)液進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Sygene Bio-ID凝膠成像系統(tǒng)采集圖片，進行灰度分析。分別采用G-6-Pase、PPAR-α與GAPDH條帶灰度值的比值作為其mRNA表達量參數(shù)。

肝臟PPAR-α蛋白表達水平檢測采用放射性免疫沉淀(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液提取肝臟總蛋白，取100 μg蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，濕法電轉(zhuǎn)2 h至硝酸纖維素膜(NC膜)，5%脫脂奶粉常溫下封閉2 h，放入兔抗鼠PPAR-α多克隆一抗工作液(1∶500)中，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，將洗滌后的NC膜放入山羊抗兔熒光二抗工作液中(1∶10 000)，常溫下避光慢搖1 h，TBST 洗膜3次，每次10 min。用Odyssey紅外熒光掃描儀進行掃描，并用其軟件進行條帶灰度分析。

結(jié) 果

db/db小鼠一般情況整個實驗期間，db/db組小鼠的進食量均顯著高于db/m小鼠(P<0.05)；但無論是db/db小鼠還是db/m小鼠，CGA組與對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。db/db小鼠的體重、體脂百分比、FPG、TG、TC及肝臟和骨骼肌中的TG含量均明顯高于db/m小鼠 (P均<0.05)，符合自發(fā)性肥胖糖尿病模型。

CGA對體重、Lee′s指數(shù)和體脂百分比的影響給予CGA 12周后，db/db-CGA組小鼠的體重、Lee′s 指數(shù)和體脂百分比與db/db-CON組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；db/m-CGA組小鼠與db/m-CON組相比差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)(表1)。

CGA對血生化指標(biāo)的影響給予CGA 12周后，db/db-CGA組小鼠的FPG和TG水平明顯低于db/db-CON組(P均<0.05)，且TG降低至正常水平，與db/m-CGA組小鼠差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；血漿TC、FFA、胰島素水平與db/db-CON組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。db/m-CGA組小鼠的各項指標(biāo)與db/m-CON組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)(表2)。

CGA對肝臟、骨骼肌中脂質(zhì)和糖原含量的影響給予CGA 12周后，在db/db-CGA組小鼠肝臟和骨骼肌中的TG水平分別較db/db-CON組降低21%和32%(P均<0.05)，肌糖原含量較db/db-CON組升高46%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；肝臟中糖原含量與db/db-CON組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。db/m-CGA組小鼠上述各項指標(biāo)與db/m-CON組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)(表2)。

表 1 氯原酸對db/db和db/m小鼠體重、Lee′s指數(shù)和體脂百分比的影響

表 2 氯原酸對db/db和db/m小鼠血生化指標(biāo)、組織TG和糖原含量的影響

FPG：空腹血糖；FFA：游離脂肪酸；TG：三酰甘油；TC：總膽固醇；與db/db-CON組相比，aP<0.05

FPG：fasting plasma glucose；FFA：free fatty acid；TG：triglyceride；TC：total cholesterol；aP<0.05 compared with db/db-CON group

CGA對脂肪組織脂聯(lián)素和內(nèi)脂素含量的影響給予CGA 12周后，db/db-CGA組小鼠脂肪組織的脂聯(lián)素水平為(6.45±1.56)mg/L，較db/db-CON組的(3.52±1.00)mg/L明顯提高了83%(P<0.01)，明顯低于db/m-CGA組的(18.7±5.48)mg/L(P<0.05)；內(nèi)脂素水平為(6.32±2.05)ng/ml，較db/db-CON組的(17.8±4.82)ng/ml明顯降低64%(P<0.01)，明顯高于db/m-CGA組的(2.64±0.48)ng/ml(P<0.05)。db/m-CON組小鼠的脂聯(lián)素水平為(18.8±2.97)mg/L，明顯高于db/db-CON組(P<0.05)；內(nèi)脂素水平為(3.51±0.92)ng/ml，明顯低于db/db-CON組(P<0.05)。

CGA：氯原酸；G-6-Pase：葡萄糖-6-磷酸酶； GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；與db/db-CON組比較，aP<0.05CGA：chlorogenic acid; G-6-Pase: glucose-6-phosphatase; GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;aP<0.05 compared with db/db-CON group

CGA對肝臟G-6-Pase和PPAR-αmRNA表達水平的影響給予CGA12周后，db/db-CGA組小鼠肝臟G-6-Pase mRNA表達水平較db/db-CON組下降51%(P<0.05)(圖1)， PPAR-α mRNA表達水平較db/db-CON組升高60%(P<0.05)(圖2)。

CGA對肝臟PPAR-α的蛋白表達水平的影響給予CGA12周后，db/db-CGA組小鼠肝臟PPAR-α 蛋白表達量較db/db-CON組升高89%(P<0.05)(圖3)。

討 論

db/db小鼠是一種leptin基因受體缺陷而引起的自發(fā)性肥胖糖尿病模型，其體內(nèi)糖脂代謝紊亂與人2型糖尿病發(fā)生相似。本研究通過對db/db小鼠進行12周的CGA干預(yù)，發(fā)現(xiàn)CGA能夠顯著降低db/db小鼠FBG及血漿、肝臟和骨骼肌中的TG水平，與前期利用高脂誘導(dǎo)的體外細胞和動物體內(nèi)糖脂代謝紊亂的作用結(jié)果一致[4-5]，表明CGA不僅對高脂誘導(dǎo)肥

PPAR-α：過氧化物酶體增殖物激活受體-α；與db/db-CON組比較，aP<0.05PPAR-α: peroxisome proliferator-activated receptor-α; aP<0.05 compared with db/db-CON group

與db/db-CON組比較，aP<0.05aP<0.05 compared with db/db-CON group

胖所致糖脂代謝紊亂有調(diào)節(jié)作用，對自發(fā)性肥胖糖尿病中的糖脂代謝紊亂也具有顯著改善作用。

肥胖糖尿病機體肝臟葡萄糖產(chǎn)生增多(糖異生和糖原分解)和肌肉葡萄糖攝取減少可導(dǎo)致血糖升高[7]。G-6-Pase是糖異生的關(guān)鍵酶之一，其表達的下降能夠顯著降低FBG。肌糖原作為體內(nèi)糖儲存和外周糖利用的途徑之一，在血糖維持上也起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)CGA在降低db/db小鼠FBG的同時，下調(diào)了肝臟G-6-Pase的mRNA表達水平，增加了肌糖原含量，而肝糖原無顯著變化，表明CGA可能作為G-6-Pase抑制劑[8]，減少肝糖輸出，以及增加外周組織肌糖原儲備，而發(fā)揮其降血糖作用。

內(nèi)臟脂肪組織作為內(nèi)分泌器官，分泌脂肪因子如脂聯(lián)素、內(nèi)脂素、抵抗素等，這些脂肪因子與肥胖糖尿病的胰島素抵抗有著密切聯(lián)系[9]。PPAR-α是配體激活轉(zhuǎn)錄因子受體之一，能夠增強線粒體脂肪酸β氧化，降低脂質(zhì)合成，從而減少脂質(zhì)沉積，改善胰島素抵抗[10]。研究顯示，脂聯(lián)素能夠通過上調(diào)PPAR-α表達，增強胰島素敏感性，改善糖脂代謝紊亂[11-12]。肥胖糖尿病患者內(nèi)臟脂肪含量較健康人增多，其體內(nèi)血清脂聯(lián)素水平顯著下降，內(nèi)脂素水平顯著高于正常人群。脂聯(lián)素降低能夠抑制機體AMPK通路和下調(diào)PPAR-α表達，使機體脂肪酸降低，脂質(zhì)合成及骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運下降，影響糖脂代謝[13]；升高的內(nèi)脂素能夠促進炎癥因子產(chǎn)生，引起機體慢性低度炎癥，從而導(dǎo)致胰島素抵抗，影響糖脂代謝[14]。本研究結(jié)果顯示，CGA可以顯著增加db/db小鼠內(nèi)臟脂肪組織中脂聯(lián)素含量，降低內(nèi)脂素含量，上調(diào)肝臟PPAR-α mRNA和蛋白表達水平，增加肌糖原，降低肝臟和骨骼肌TG水平；Cho等[12]在高脂誘導(dǎo)肥胖ICR小鼠中發(fā)現(xiàn)，CGA可以促進脂聯(lián)素分泌，增加一系列脂肪酸氧化酶活性，這些結(jié)果提示CGA可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素和內(nèi)脂素分泌，增加胰島素敏感性，促進肝外組織葡萄糖轉(zhuǎn)運，增強脂肪氧化，改善肥胖糖尿病的糖脂代謝紊亂，降低血糖和血脂。值得注意的是，本研究中沒有觀察到體脂含量的變化，提示CGA可能通過更新內(nèi)臟脂肪組織，改善脂肪因子分泌。

此外，本研究在連續(xù)12周的干預(yù)過程中，未發(fā)現(xiàn)CGA對db/m小鼠的糖脂代謝有任何不良影響，提示CGA對正常小鼠的糖脂代謝無不良反應(yīng)，這為利用CGA預(yù)防和治療2型糖尿病提供了安全性評價依據(jù)。

本研究的重要發(fā)現(xiàn)是長期給予CGA能夠改善自發(fā)性肥胖糖尿病糖脂代謝紊亂，其作用可能與調(diào)節(jié)脂肪因子分泌，上調(diào)肝臟PPAR-α表達及減少肝糖輸出、增加肌糖原儲備有關(guān)，其詳細機理仍需進一步研究，以便為CGA調(diào)節(jié)糖脂代謝，防治2型糖尿病提供新的途徑和方法。

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EffectofChlorogenicAcidonDisorderedGlucoseandLipidMetabolismindb/dbMiceandItsMechanism

ZHANG Lan-tao,CHANG Cui-qing,LIU Yang,CHEN Zhi-min

Institute of Sports Medicine, the Third Hospital, Peking University, Beijing 100191,China

CHANG Cui-qing Tel:010-82265635, E-mail:cuiqingchang@yahoo.com.cn

ObjectiveTo explore the effect of chlorogenic acid on disordered glucose and lipid metabolism in db/db mice and its mechanism.MethodsThirteen 5-6-week-old male db/db mice were randomly divided into db/db-CGA group (n=7) and db/db-CON group (n=6), and thirteen 5-6-week-old male db/m mice were randomly divided into db/m-CGA group (n=6) and db/m-CON group (n=7). Mice in the CGA groups were administrated with CGA 80 mg/(kg·d)by gavage, and mice in the CON groups were administrated with PBS in the same volume by gavage. Twelve weeks later, the level of biomedical parameters in plasma, liver, and skeletal muscle were determined, the concentrations of adiponectin and visfatin in visceral adipose, and the mRNA expression of glucose-6-phosphatase (G-6-Pase) and peroxisome proliferators-activated receptor-α (PPAR-α) as well as the protein level of PPAR-α in liver were detected.ResultsTwelve weeks after CGA administration, the levels of triglycerides in plasma, liver, and skeletal muscle and the fasting plasma glucose in db/db-CGA group were significantly lower than those in db/db-CON group(P<0.05). The muscle glycogen level was significantly higher than that in db/db-CON group (P<0.05), and the adiponectin concentration was significantly higher than that in db/db-CON group (P<0.01) and lower than that in db/m-CGA group(P<0.05). The visfatin concentration in db/db-CGA group was significantly lower than that in db/db-CON group (P<0.01) and significantly higher than that in db/m-CGA group(P<0.05). The mRNA expression level of G-6-Pase was significantly down-regulated in db/db-CGA group when compared with db/db-CON group (P<0.05). Both the mRNA and the protein expression levels of PPAR-α were significantly up-regulated in db/db-CGA group(P<0.05) compared with in db/db-CON group.ConclusionCGA improves the disordered glucose/lipid metabolism in db/db mice, which is speculated to be related with its role in modulating the adipokines secretion, up-regulating hepatic PPAR-α, and inhibiting G-6-Pase expression.

chlorogenic acid; glucose-lipid metabolism; adiponectin; visfatin; db/db mice

ActaAcadMedSin，2011，33(3)：281-286

常翠青 電話：010-82265635,電子郵件:cuiqingchang@yahoo.com.cn

R151.2

A

1000-503X(2011)03-0281-06

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.03.015

國家自然科學(xué)基金(30872112)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (30872112)

2011-04-08)