胡居吾，李雄輝*，熊 偉，季清榮，涂招秀，李向陽

1江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所;2江西省科院天工科技有限責(zé)任公司，南昌330029

響應(yīng)面法優(yōu)化混合酶-超聲波聯(lián)合提取梔子黃色素工藝研究

胡居吾1，李雄輝1*，熊 偉1，季清榮2，涂招秀1，李向陽1

1江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所;2江西省科院天工科技有限責(zé)任公司，南昌330029

以梔子為原料提取梔子黃色素，將混合酶-超聲波技術(shù)相結(jié)合，對(duì)梔子黃色素進(jìn)行了提取的研究。為了獲得提取梔子黃色素最佳工藝條件，采用響應(yīng)面法組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法，建立了酶的用量、提取溫度、提取時(shí)間之間關(guān)系。結(jié)果表明，最佳工藝條件為酶的用量4.33%，提取溫度61.84℃，提取時(shí)間65.06 min，在此最佳提取條件下，梔子黃色素的吸光度為0.914。

梔子黃色素;響應(yīng)面分析;超聲提取

梔子(Gardenia jasminoides Ellis)為茜草科植物，又名黃梔子、山枝子、大紅梔子(江蘇)、白蟬(廣東)。梔子主治感冒、發(fā)熱、煩躁、失眠等［1］。梔子果中黃色素約占果實(shí)重量的10%［2］，梔子黃色素為橙色粉末，易溶于水，溶液透明，無異味;難溶于無水乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。由于梔子果中含有大量的果膠和纖維素等物質(zhì)，使得梔子黃色素在提取過程中不容易溶解出來，故本研究在梔子黃色素的提取過程中，加入果膠酶和纖維素酶組成的混合酶(果膠酶∶纖維素酶=1.5∶1)，可以大大提高梔子黃色素的提取率，同時(shí)又能使梔子黃色素后續(xù)的純化過程降低難度。同時(shí)在提取過程中采用超聲波的輔助作用將細(xì)胞破碎，使被提取物能夠快速、高效地進(jìn)入提取介質(zhì)，縮短提取時(shí)間，增加提取效率。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中采用了響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，有助于快速建模、縮短優(yōu)化時(shí)間和提高工程應(yīng)用可信度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梔子購(gòu)于江西省撫州市江西天順生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，在50～75℃之間程序升溫干燥，時(shí)間為2～3 h，后粉碎過40目篩;梔子黃色素標(biāo)準(zhǔn)品:北京生物制品檢驗(yàn)中心;果膠酶(固體型:5萬U/g)、纖維素酶(固體型:3萬U/g)張家港市金源生物化工有限公司;超聲波循環(huán)發(fā)生器(HF-5B)北京弘祥科技公司;紫外分光光度計(jì)(751型)上海第二分析儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52AA)北京醫(yī)用離心機(jī)廠;YC-015實(shí)驗(yàn)室微型噴霧干燥機(jī)上海雅程儀器設(shè)備有限公司;電子天平(AE163)余姚紀(jì)銘設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

梔子果→干燥→脫殼→粉碎→過篩(40目)→水提(料液比1∶9)→第一次加入一定量的混合酶→在一定的溫度下超聲(250 W)提取一定的時(shí)間→紗布過濾→第二次(料液比1∶7)不再加入混合酶，在上述溫度下超聲(250 W)提取相同的時(shí)間→紗布過濾→合并濾液→離心(4500 r/min，10 min)→上清液→檢測(cè)其吸光度(波長(zhǎng)440 nm)→噴霧干燥→產(chǎn)品。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 混和酶用量的確定

分別稱取10 g原料放入錐形瓶中，加入相同體積的水，然后分別加入3.0%、4.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%(與原料重量比)的混和酶，在額定功率、相同的時(shí)間和溫度下進(jìn)行超聲提取，分別測(cè)定溶液的吸光度。

1.2.2.2 提取溫度的確定

分別稱取10 g原料放入錐形瓶中，加入相同體積的水，然后在50、55、60、65、70、75℃的恒溫水浴中，在額定功率、相同的時(shí)間和一定酶用量下進(jìn)行超聲提取，分別測(cè)定溶液的吸光度。

1.2.2.3 提取時(shí)間的確定

分別稱取10 g原料放入錐形瓶中，加入相同體積的水，然后在60、65、70、75、80 min下，并在額定功率、相同的溫度和一定酶用量下進(jìn)行超聲提取，分別測(cè)定溶液的吸光度。

1.2.3 測(cè)定方法

取離心后的上清液1 mL定容于250 mL容量瓶，再稀釋30倍，在波長(zhǎng)440 nm處測(cè)定其吸光度。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化梔子黃色素的提取工藝

在正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取混合酶的用量、提取溫度及提取時(shí)間對(duì)本試驗(yàn)主要影響的三個(gè)因素，設(shè)試驗(yàn)因素與水平，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，每一個(gè)自變量設(shè)計(jì)低中高三個(gè)水平。見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Levers and code of response surface experiments

設(shè)該模型通過最小二乘法擬合的二次多項(xiàng)方程為:

Y=X0+X1A+X2B+X3C+X12AB+X13AC+ X23BC+X11A2+X22B2+X33C2式中:Y—預(yù)測(cè)響應(yīng)值;X0—常數(shù)項(xiàng);X1、X2、X3—線性系數(shù);X12、X13、X23—交互項(xiàng)系數(shù);X11、X22、X33—二次項(xiàng)系數(shù);

2 結(jié)果和分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 混和酶的用量對(duì)梔子黃色素吸光值的影響

圖1 混和酶的用量對(duì)梔子黃色素吸光值的影響Fig.1 Effects of mixed-enzyme dosage on absorbance of gardenia yellow

由圖1可知，隨著混和酶的用量的增加，梔子黃色素吸光值增大，但用量達(dá)到6.0%以后，吸光值不再增大，這時(shí)與酶作用的底物已反應(yīng)完全，故混和酶的用量在5.5～6.0之間。

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)梔子黃色素吸光值的影響

圖2 溫度對(duì)梔子黃色素吸光值的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on absorbance of gardenia yellow

由圖2可知，隨著提取溫度的上升，梔子黃色素吸光值增大，本實(shí)驗(yàn)最終選在60～70℃之間，原因是隨著溫度的增加(大于70℃)，可能會(huì)破壞梔子黃色素的結(jié)構(gòu)，同時(shí)在大于70℃時(shí)，混和酶在高溫下其活性會(huì)降低，甚至?xí)Щ睢?/p>

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)梔子黃色素吸光值的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)梔子黃色素吸光值的影響Fig.3 Effects of extraction time on absorbance of gardenia yellow

由圖3可知，超聲時(shí)間在50～60 min時(shí)，梔子黃色素吸光值最大，也就是梔子黃色素的得率最高。隨著的再延長(zhǎng)，其得率降低，其原因可能是由于超聲時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)破壞梔子黃色素的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其吸光值下降。故超聲取提取時(shí)間在60 min左右為宜。

2.2 響應(yīng)值結(jié)果及其擬合模型

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合正交試驗(yàn)所得結(jié)果，選取混合酶的用量、提取溫度及提取時(shí)間對(duì)本試驗(yàn)主要影響的三個(gè)因素，對(duì)提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，其具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

2.3 模型方程的建立及顯著性分析

表2為不同試驗(yàn)條件下所測(cè)定的吸光度值，利用Design-expert 6.0.5軟件和SAS 8.2軟件對(duì)表2中吸光度值進(jìn)行多元回歸擬合，表3為回歸分析結(jié)果，當(dāng)“Prob＞F”值小于0.05即表示該項(xiàng)指標(biāo)顯著，說明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于梔子黃色素吸光度值試驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)?；貧w方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果還表明方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響都是高度顯著的。各因素經(jīng)回歸擬合后，選擇對(duì)響應(yīng)值顯著的各項(xiàng)，得到吸光度值對(duì)編碼自變量混合酶的用量、提取溫度和提取時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程為:

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Analysis and result of response surface experiments

表3 回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)Table 3 Regression coefficients and their significance

注:“P＜0.05”表示差異顯著;Note:“P＜0.05”means difference significant

2.4 主因子效應(yīng)分析

從表3可以得出:MSx1=0.000561;MSx2= 0.004513;MSx3=0.0004095;所以，影響梔子黃色素提取的三因素主次順序是:提取溫度＞提取時(shí)間＞酶的用量。

2.5 梔子黃色素的響應(yīng)曲面分析

RSM法的圖形是特定的響應(yīng)面y對(duì)應(yīng)的因素x1、x2、x3構(gòu)成的一個(gè)三維空間在二維平面上的等高圖，可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，從實(shí)驗(yàn)所得的響應(yīng)面分析圖上可以找到它們?cè)诜磻?yīng)過程中的相互作用。相應(yīng)曲面圖和等高線圖4所示。

圖4 y=f(x1、x2、x3)的響應(yīng)面與等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot

由圖4可知，在一定的時(shí)間(X3)下，升高提取溫度(X2)可以先增大梔子黃色素的吸光度，后又呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，可能由于隨著溫度的升高，一是造成溶液中的色素不穩(wěn)定分解;二是使混合酶部分失活，因?yàn)檫@兩種酶的最適溫度都在55～65℃左右，所以當(dāng)溫度在55～65℃之間，吸光度較高。

2.6 最佳工藝條件的選擇

通過軟件Design-Expert 6.0.5和SAS 8.2求解方程，給出了最佳萃取工藝條件為:酶的用量4.33%，提取溫度61.84℃，提取時(shí)間65.06 min，在此最佳提取條件下，梔子黃色素的吸光度為0.914。證實(shí)驗(yàn)中的工藝條件為:酶的用量4.33%，提取溫度62.00℃，提取時(shí)間65.00 min，驗(yàn)證結(jié)果較好。

2.7 噴霧干燥

最后在上述的最佳萃取條件下，將上清液進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為180℃，出口溫度為90℃，得達(dá)梔子黃色素粉末。與不加上述混合酶相比，提取率增加了12.4%。

3 結(jié)論

3.1 從梔子中提取黃色素屬于傳質(zhì)過程，本實(shí)驗(yàn)借助超聲波產(chǎn)生的脈動(dòng)、機(jī)械振動(dòng)、擴(kuò)散、乳化、擊碎等作用，可以大大地增加流體湍流程度及相接觸面，從而強(qiáng)化了傳質(zhì);另外，介質(zhì)吸收超聲波后，能將其轉(zhuǎn)化成熱能，從而導(dǎo)致物料內(nèi)部溫度升高，加速了有效成分的溶解，有效地提高了色素的提取速率。超聲波提取法與常規(guī)法相比較，具有提取時(shí)間短、色素提取率高等優(yōu)點(diǎn)，可以大大地提高生產(chǎn)效率。

3.2 在超聲波提取過程中，加入纖維素酶時(shí)，破壞植物細(xì)胞壁，使梔子黃色素快速?gòu)臈d子果實(shí)中全部溶出來，并可以降低提取溫度，從而可以節(jié)省能源和防止黃色素在溫度下分解;梔子中含有大量的果膠，果膠會(huì)隨著提取梔子黃色素時(shí)也會(huì)大量溶于水中，果膠會(huì)很容易凝固，使提取液很難過濾，并且會(huì)使梔子黃色素得率降低，當(dāng)加入果膠酶后，可有效的防止上述情況的發(fā)生。

3.3 有關(guān)研究表明［3］，梔子黃色素在pH 3.5～11.0之間比較穩(wěn)定，但在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿中，觀察到溶液顏色變淡，吸光度明顯變小，這主要是因?yàn)閺?qiáng)酸、強(qiáng)堿破壞藏花、藏花酸的結(jié)構(gòu);同時(shí)纖維素酶和果膠酶的最適pH范圍在3.5～5.0之間，故整個(gè)提取體系中用調(diào)酸調(diào)至3.5～5.0之間。

3.4 在本實(shí)驗(yàn)中沒有對(duì)物料與提取溶劑之間的關(guān)系作研究，第一次提取時(shí)的料液比為1∶9，第二次的料液比為1∶7。

3.5 結(jié)果表明，在提取工藝條件中，當(dāng)酶的用量4.33%，提取溫度61.84℃，提取時(shí)間65.06 min。證實(shí)驗(yàn)中的工藝條件為:酶的用量4.33%，提取溫度62.00℃，提取時(shí)間65.00 min，驗(yàn)證結(jié)果較好。在此最佳提取條件下，梔子黃色素的吸光度為0.914，處于較高水平，這為梔子黃色素的工業(yè)生產(chǎn)及后續(xù)精制純化工藝提供了可借鑒的理論依據(jù)。通過實(shí)驗(yàn)表明，加入酶能提高提取率，并縮短提取時(shí)間，而且在最終得到較純品時(shí)，送到檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，表明加入的這兩種酶不會(huì)破壞梔子黃色素的結(jié)構(gòu)。3.6 用吸光度的方法測(cè)其吸光度時(shí)，在波長(zhǎng)440 nm處，酶解產(chǎn)物及其它物質(zhì)對(duì)吸光度的影響不大，我們用HPLC法作了對(duì)比，相差不到2%，而且在實(shí)驗(yàn)過程中，用吸光度法測(cè)量更方便。

1 Liu CL(劉成倫)，Xu LJ(徐龍君).Study advance on the Gardenia pigments.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，1996，(6):69-73.

2 Ma ZC(馬自超)，Peng YZ(龐業(yè)珍).Chemistry of Edible Pigment and Produce Technology.Beijing:China Forestry Publishing House，994.25-36.

3Yao LX(姚立霞)，Wang XL(汪雪麗)，Du XF(杜先鋒).Optimization of ultrasonic extraction technology of gardenia yellow.Food Sci(食品科學(xué))，2008，29:197-199.

Optimization of Mixed-Enzymes and Ultrasonic Extraction Technology of Gardenia Yellow by Response Surface Method

HU Ju-wu1，LI Xiong-hui1*，XIONG Wei1，JI Qing-rong2，TU Zhao-xiu1，LI Xiang-yang11Institute of Applied Chemistry，Jiangxi Academy of Sciences;2Tian-Gong Technology Co.，Ltd.of Academy of Sciences，Nanchang 330029，China

The extraction of gardenia yellow from Gardenia jasminoides Ellis was studied in this paper and gardenia yellow was extracted by mixed-enzymes and ultrasonic extraction technology，and the mathematical model of correlation among enzyme dosage，extraction temperature，extraction time were established by means of response surface method.The results indicated that the optimum extraction conditions are as follows:enzyme dosage 4.33%，extraction temperature 61.84℃，and extraction time 65.06 min.Under these conditions，the absorbance of gardenia yellow is 0.914.

gardenia yellow;response surface method;ultrasonic extraction

1001-6880(2011)03-0551-05

2009-11-09 接受日期:2010-04-08

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2008GB2C500163)

*通訊作者 E-mail:kxylxh0215@126.com

R284.2;Q946.91

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