花 慧，馮 磊，張小平，張蓮芬，金 堅*

1江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院分子藥理研究室;2江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫214122;3無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，無錫214028

合歡皮為較常用中藥，中國藥典(一部)2000年版規(guī)定，合歡皮為合歡的干燥莖皮，具有解郁安神、活血消腫的作用、用于心神不安、憂郁失眠、肺癰瘡腫、跌撲傷痛等癥［1］。研究表明，合歡皮中化學(xué)成分較多，陳四平［2］等利用HPLC制備技術(shù)，從合歡皮乙醇提取物的正丁醇萃取部位分離得到一系列結(jié)構(gòu)復(fù)雜的三萜苷類化合物。Julibroside J8是從合歡皮分離得到一種含九個糖三萜皂甙，鄭路［3］等人研究表明其體外具有抑BGC-823、Bel-7402、HeLa、PC-3MIE8、MDA-MB-435和HL-60細胞的活性，具有經(jīng)caspase家族及Bcl家族共同調(diào)控誘導(dǎo)Hela細胞凋亡的作用，但它是否具有抑制人微血管內(nèi)皮細胞的作用尚不清楚。本研究旨在探討Julibroside J8對人微血管內(nèi)皮細胞的生長抑制作用及其可能的機制。

1 材料

SV40病毒轉(zhuǎn)染的人微血管內(nèi)皮細胞(HMEC-1)傳代株由法國國家衛(wèi)生醫(yī)學(xué)研究院U553研究所(INSERM U553)陸核教授饋贈;SRB(Sigma公司); MCDB-131細胞培養(yǎng)基(Gibco BRL公司);胰酶、小牛血清、L-谷氨酰胺(華美生物工程公司);DAPI染液、TUNEL試劑盒(凱基生物公司);Annexin-V/PI雙標(biāo)記試劑盒(BD PharMin-gen公司)。

合歡皮購自江蘇省無錫市山禾藥業(yè)股份有限公司，由南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為 Albizia julibrissin Durazz.的干燥樹皮。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將HMEC-1用含1 mmol/L谷氨酰胺、1 mg/L氫化可的松、10 μg/L EGF和150 mL/L小牛血清的MCDB-131培養(yǎng)液，于37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

2.2 合歡皂甙Julibroside J8的制備

將1 kg合歡皮分別用8 L、7 L 75%乙醇，100℃回流提取兩次，每次2 h，過濾，去渣。合并濾液，減壓回收乙醇，得浸膏120g，將所得浸膏經(jīng)D101型大孔樹脂吸附，再用水，30%乙醇，50%乙醇70%乙醇，90%乙醇各洗脫3個柱體積，收集各相，將70%乙醇相得浸膏，用100～200目的硅膠常壓分離，用體積比氯仿∶甲醇∶水為9∶1∶0.1～6.5∶3.5∶1梯度洗脫，等體積(300 mL)收集，將第33～44瓶合并，回收溶劑得浸膏，用反相色譜(色譜柱Sunfire C18，5 μL，100A，19×150 mmID;流動相∶甲醇-水70∶30，流速:5 mL/min，紫外檢測波長:215 nm)中壓分離，按色譜單峰收集，回收溶劑，冷凍干燥得有效組分A1，經(jīng)HPLC分析純度為95.5%，將組分A1的UV、MS、IR、1H NMR、13C NMR圖譜的數(shù)據(jù)與文獻［4］逐一比對。確定其為化合物合歡皂甙Julibroside J8結(jié)構(gòu)見圖1。將Julibroside J8溶解于細胞培養(yǎng)基中過濾滅菌備用。

2.3 細胞增殖抑制實驗(SRB法)

取對數(shù)生長期細胞，按每孔7000-8000個細胞接種于96孔板中放置于37℃、50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，加入不同濃度的合歡皂甙Julibroside J8(0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 μg/mL)每個濃度設(shè)藥物作用時間6、12、24、48 h。且同時設(shè)相應(yīng)不加藥組為陰性對照組。在撤去藥物后繼續(xù)培養(yǎng)至72 h去上清液，每孔輕輕加入100 g/L三氯醋酸100 μL固定，靜置5 min后移到4℃再放置1 h倒掉固定液，用去離子水洗5遍，空氣干燥。每孔加入4 g/L SRB 100 μL室溫放置30 min，用10 mL/L醋酸液洗5遍，加入150 μL 10 mmol/L Tris堿液(pH 10.5)溶解，用MK3型酶標(biāo)儀在波長A570處測定每孔A值。計算抑制率(%)同時繪制藥物濃度抑制率曲線，抑制率=［(對照組的A值–藥物組的A值)/(對照組的A值-空白組的A值)］×100%

2.4 DAPI染色觀察細胞核變化

取對數(shù)生長期的HMEC-1細胞，接種到培養(yǎng)皿中(預(yù)先放置蓋玻片)培養(yǎng)24 h，細胞在蓋玻片上生長貼壁后，加入 Julibroside J8，使其終濃度為1.5 μg/mL，空白對照不加Julibroside J8，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，小心取出蓋玻片，加500 μL的DAPI染液洗一次;再滴加入500 μL的DAPI工作液，37℃染色15 min;棄去染色液，甲醇漂洗一次，滴加甘油。熒光顯微鏡以340/380 nm紫外光激發(fā)，以100×油鏡頭觀察、拍照。

2.5 TUNEL染色法

取對數(shù)生長期的HMEC-1細胞，接種到培養(yǎng)皿中(預(yù)先放置蓋玻片)培養(yǎng)24 h，細胞在蓋玻片上生長貼壁后，加入不同濃度的合歡皂甙Julibroside J8(0.5、1.5、2.5 μg/mL)作用時間48 h。且同時設(shè)相應(yīng)不加藥組為陰性對照組。以下操作嚴(yán)格按照說明書進行。

2.6 采用Annexin-Ⅴ/PI雙標(biāo)記行流式細胞儀測定細胞凋亡率

取對數(shù)生長期的HMEC-1細胞，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，細胞濃度為5×105個/瓶，24 h后加Julibroside J8，使其終濃度為0.5～2.5 μg/mL，同時不加Julibroside J8為空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，據(jù)Annexin-V/PI雙標(biāo)記試劑盒說明操作。流式細胞儀分析，每樣本收集10 000個細胞熒光信號，檢測結(jié)果采用Cellquest軟件分析。

2.7 統(tǒng)計分析

采用SPSS 1310軟件進行分析，組間比較采用方差分析。

圖1 Julibroside J8的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖和對HMEC-1細胞的作用Fig.1 Chemical structure and effect of Julibroside J8on HMEC-1 cells

3 結(jié)果

3.1 Julibroside J8對HMEC-1增殖的影響

在不同濃度Julibroside J8作用下，Julibroside J8對內(nèi)皮細胞HEMC-1均有不同的抑制作用。Julibroside J8呈劑量依賴性抑制HEMC-1細胞的增殖，抑制作用隨著Julibroside J8的濃度以及作用時間的增加而增強。在作用濃度1 μg/mL，作用時間6 h時，抑制率達到35%。統(tǒng)計學(xué)分析差異顯著(P＜0.01)。

3.2 Julibroside J8對HMEC-1細胞核形態(tài)的影響

HMEC-1細胞爬片后，經(jīng)DAPI染色后熒光顯微鏡拍照結(jié)果如圖2。HMEC-1空白對照細胞較弱的藍色熒光，核形態(tài)呈橢圓形，邊緣清晰，染色均勻，細胞經(jīng)樣品作用后，產(chǎn)生很強藍光染色。并且細胞的細胞核邊緣不規(guī)則，細胞核染色體濃集，著色較重，并伴有細胞核固縮，核小體碎片增加這是細胞凋亡的明顯特征。

圖2 DAPI染色觀察HMEC-1細胞形態(tài)的變化Fig.2 The morphological changes of HMEC-1 cells by DAPI dying with microscopy

3.3 TUNEL檢測細胞在凋亡過程中細胞核DNA的斷裂

HMEC-1細胞爬片后，經(jīng)TUNEL染色后光學(xué)顯微鏡拍照如圖3。由圖中可以看到，HMEC-1空白對照細胞核呈較弱的藍色，核形態(tài)呈橢圓形，邊緣清晰，染色均勻，細胞經(jīng)樣品作用后，細胞核呈深棕色。表明細胞經(jīng)藥物作用后產(chǎn)生了凋亡。且隨著劑量的增加細胞核呈深棕色的細胞比例也在增加，呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。

圖3 TUNEL染色觀察HMEC-1細胞核中DNA斷裂Fig.3 Effect of Julibroside J8on DNA fragmentation in HMEC-1 cells

3.4 檢測細胞壞死與凋亡:Annexin V/PI雙染色流式細胞術(shù)檢測

HMEC-1細胞經(jīng)不同濃度的樣品作用24 h后，分別經(jīng)胰酶消化，收集5×105～106個細胞，根據(jù)試劑盒說明書進行Annexin V/PI雙染色，立即用流式細胞儀檢測，結(jié)果如圖4。在不同的濃度Julibroside J8作用下，隨加樣濃度的增大，處于右下象限的細胞即凋亡細胞明顯增多，當(dāng)Julibroside J8的濃度依次為 0.5、1.5、2.5 μg/mL時，凋亡率分別達到13.63% ±3.10%，19.55% ±4.69%，32.32% ± 6.19%，而正常對照組細胞凋亡率為 8.34% ± 2.90%。二者統(tǒng)計學(xué)分析差異顯著(P＜0.05)。

圖4 AnnexinⅤ/PI雙染色法流式細胞術(shù)檢測HMEC-1細胞的壞死與凋亡Fig.4 Representative flow cytometry analysis of cell necrosis and cell apoptosis induction in HMEC-1 cell incubated 24 h with Julibroside J8

4 討論

1971年，F(xiàn)olkman提出腫瘤生長是血管生成依賴性的新觀點，并提出了“抗血管生成治療”的概念［5］。血管生成(angiogenesis)是指毛細血管從已存在的血管周圍生成的過程，包括血管內(nèi)皮細胞的激活、細胞外基質(zhì)的降解、內(nèi)皮細胞的增殖與移行、形成新的血管和血管網(wǎng)，因此以血管內(nèi)皮細胞為藥物作用靶點從中草藥中尋找發(fā)現(xiàn)新的血管生成抑制劑正日益成為目前研究腫瘤轉(zhuǎn)移的熱點。

根據(jù)以上理念，我們首先通過體內(nèi)，體外模型確定了中藥合歡皮的提取物的抑制血管生成的作用［6］，繼而以血管內(nèi)皮細胞為模型，綜合運用多種分離手段從合歡皮中篩選分析得到Julibroside J8。體外細胞抑制實驗結(jié)果顯示內(nèi)皮細胞經(jīng)不同濃度Julibroside J8，作用6 h后生長就受到抑制，表明Julibroside J8對內(nèi)皮細胞的抑制作用不是因為改變細胞的生長環(huán)境而產(chǎn)生的，而是對細胞本身發(fā)生了作用。為了探明Julibroside J8抑制內(nèi)皮細胞增殖的原因我們采用以下三個實驗進行了分析研究。

DAPI染色法:DAPI(4，6-Diamidino-2-phenylindole，4，6-二氨基-2-苯基吲哚)是一種DNA特異性染料，與DNA產(chǎn)生非嵌入式結(jié)合，發(fā)出藍色熒光。該染料對細胞膜有半通透性，可透過正?；罴毎a(chǎn)生較弱的藍色熒光(細胞固定后熒光增強)，而凋亡細胞的膜通透性增加，對其攝取能力增強，產(chǎn)生很強藍光染色。并且正常細胞的核形態(tài)呈圓形，邊緣清晰，染色均勻，而凋亡細胞的細胞核邊緣不規(guī)則，細胞核染色體濃集，著色較重，并伴有細胞核固縮，核小體碎片增加，因此從熒光強度及核形態(tài)均可鑒別出細胞發(fā)生凋亡的典型特征。TUNEL染色法則利用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用標(biāo)記熒光素于凋亡細胞中斷裂DNA的3’末端，從而準(zhǔn)確地反映DNA片段的生化特點與典型的形態(tài)學(xué)特點，進行凋亡細胞的識別［7］。Annex-inV/PI雙染法應(yīng)用流式細胞儀測定是檢測細胞凋亡的常用方法，具有量化凋亡變化的能力［8］。

通過上述3項指標(biāo)檢測，結(jié)果證實Julibroside J8可以通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡的途徑達到抑制內(nèi)皮細胞增殖的作用。這與文獻［3］報道的Julibroside J8可以誘導(dǎo)HeLa凋亡的報道相一致。但其誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡的機理尚待實驗進一步證明。

1 Pharmacopoeia Committee of China(國家藥典委員會)，Chinese Pharmacopoeia(中華人民共和國藥典)，Part A，Chemistry and Industry Publishing House(化學(xué)工業(yè)出版社)，Beijing，2000，p.111.

2 Chen SP，Zhang RY，Ma LB，et al.Structure determination of three saponons from the stem bark of Albizzia julibrissin Durazz.Acta Pharm Sin，1997，32:110-115.

3 Zheng L，Zheng J，Wu LJ，et al.Julibroside J8-induced HeLa cell apoptosis through caspase pathway.J Asian Nat Prod Res，2006，8:457-465.

4 Zou K，Tong WY，Liang H，et al.Diastereoisomeric saponins from Albizia julibrissin.Carbohydr Res，2005，340:1329-34.

5 Folkman J，Shing Y.Angiogenesis.J Biol Chem，1992，267: 10931-10934.

6 Hua H(花慧)，F(xiàn)eng L(馮磊)，Zhang XP(張小平)，et al.The experimental study on the anti-angiogenenic effect of Albizia julibrissin extracts.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2010，22(2):215-218，260

7 Otsuki Y，Li Z，Shibata MA.Apoptotic detection methods from morphology to gene.Prog Histochem Cytochem，2003，38:275-339.

8 Mccloskey TW，Oyaizu N，Coronesi M，et al.Use of a flow cytometric assay to quantitate apoptosis in humanlymphocytes.Clin Immunol Immunopathol，1994，71:14-18.