劉勝姿，王留英，邱義蘭*，劉如石，王曉輝，劉少軍

(1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410081; 2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410081)

微管作為細(xì)胞骨架主要成分之一，廣泛存在于真核生物細(xì)胞中．在植物細(xì)胞中，微管通過(guò)分布狀態(tài)的變化與微絲共同參與眾多的生命活動(dòng)，如細(xì)胞形態(tài)建成、染色體遷移、細(xì)胞分裂與分化、細(xì)胞壁構(gòu)建和信號(hào)傳導(dǎo)等[1-4]．到目前為止，有關(guān)高等植物有性生殖過(guò)程中細(xì)胞骨架的研究主要集中于花粉的萌發(fā)和生長(zhǎng)與細(xì)胞骨架變化動(dòng)態(tài)的關(guān)系[5-11]．有關(guān)高等植物雄性細(xì)胞發(fā)育早期減數(shù)分裂過(guò)程中細(xì)胞骨架的研究則不多[12-16]．高等植物不同種植物的減數(shù)分裂特征不同，其微管骨架的分布變化也存在差異．本實(shí)驗(yàn)對(duì)辣椒 (CapsicumannumL.) 減數(shù)分裂過(guò)程中的微管變化進(jìn)行了觀察，探索其微管骨架分布特征，為豐富高等植物減數(shù)分裂過(guò)程中細(xì)胞骨架的作用奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

供試材料為辣椒(CapsicumannumL.) 牛角椒2號(hào)品種．4月中旬種植于湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生理網(wǎng)室．取花芽分化后減數(shù)分裂各個(gè)時(shí)期的花藥，依次進(jìn)行以下處理．

固定：用含有40 g/L多聚甲醛、100 g/L蔗糖、50 mmol·L-1PIPES緩沖液 (pH 6.9)、100 g/L二甲基亞砜和10 g/LTriton X-100的固定液在室溫條件下固定1 h，然后用50 mmol·L-1PIPES緩沖液 (pH 6.9) 沖洗3次, 每次5 min．取出花藥, 在涂有多聚賴氨酸溶液的載玻片上, 輕壓花藥使藥室內(nèi)的花粉細(xì)胞逸出．

酶解：將10 g/L的蝸牛酶(50 mmol·L-1PIPES緩沖液配制, pH 6.9)覆蓋于細(xì)胞之上, 室溫保濕酶解10～15 min．酶解后, 用50 mmol·L-1PIPES緩沖液(pH 6.9)沖洗3次，每次5 min．

免疫反應(yīng)預(yù)處理: 用10 g/L的牛血清蛋白溶液(50 mmol·L-1PIPES緩沖液配制, pH 6.9)封閉細(xì)胞1 h, 并用含NaCl 138 mmol·L-1、KCl 2.68 mmol·L-1、KH2PO41.47 mmol·L-1、Na2HPO48.1 mmol·L-1磷酸緩沖液 (PBS) 洗3次，每次5 min．

微管免疫反應(yīng): 經(jīng)上述處理過(guò)的細(xì)胞, 先與一抗——鼠抗微管蛋白(Sigma, PBS緩沖液稀釋, 稀釋度為1∶350)在一定濕度下37 ℃溫育1 h，PBS緩沖液沖洗3次, 每次10 min．再用二抗——FITC(fluorescein isothiocyanate, 異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG (Sigma, PBS緩沖液稀釋, 稀釋度為1∶200) 在一定濕度下37 ℃溫育1 h, PBS緩沖液沖洗3次, 每次10 min．

染色體及細(xì)胞核的標(biāo)記：先配置DAPI(4′,6-diamidine-2′-phenylindole, 4′,6二脒基-2-苯吲哚)母液(1 g/L), 用時(shí)用PBS緩沖液1∶300稀釋水溶液對(duì)細(xì)胞染色5 min, 隨即用PBS緩沖液沖洗．

封片及觀察：體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油封片后用Leica共聚焦激光掃描顯微鏡(Leica TCS SP5)及圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行觀察，F(xiàn)ITC激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm, DAPI激發(fā)波長(zhǎng)為364 nm．

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在小孢子母細(xì)胞時(shí)期，小孢子母細(xì)胞最顯著的特征是外面被一層厚厚的胼胝質(zhì)壁包圍(圖1a)．小孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂前的間期，細(xì)胞質(zhì)中大部分微管蛋白呈彌散分布，只有少量的微管積聚，形成細(xì)胞周質(zhì)微管，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央(圖1b)．當(dāng)小孢子母細(xì)胞由間期向分裂期過(guò)渡的時(shí)候，微管蛋白積聚成絲，呈籠形分布于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核被包裹在籠形結(jié)構(gòu)之中(圖1c)．隨著進(jìn)一步發(fā)育，小孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅰ中期，細(xì)胞中幾乎所有的微管聚合成紡錘體，染色體排列在紡錘體的赤道板，把紡錘體分隔為2個(gè)半紡錘體(圖1d)．當(dāng)小孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂I 后期，著絲粒微管向兩極拉伸縮短，將染色體拉向兩極后，它形成扁平的帽狀結(jié)構(gòu)，在2組染色體之間存在極絲微管(圖1e)，隨后在連接2組染色體的極絲微管增多，熒光強(qiáng)(圖1f)．至末期Ⅰ，2細(xì)胞核之間的微管熒光明顯減弱，由細(xì)胞核表明向四周輻射出一些微管(圖1g)．繼續(xù)向前發(fā)育，細(xì)胞質(zhì)中絲狀的微管消失，呈現(xiàn)均勻的弱熒光，而在2個(gè)子核的周圍聚集了較多的微管，熒光很強(qiáng)(圖1h)．辣椒小孢子母細(xì)胞的減數(shù)分裂屬同時(shí)型，減數(shù)分裂I結(jié)束后，在2個(gè)子核之間并沒(méi)有形成細(xì)胞壁，也沒(méi)有形成二分體．當(dāng)減數(shù)分裂II開(kāi)始后，在小孢子母細(xì)胞中又開(kāi)始形成2個(gè)紡錘體，2個(gè)子核的紡錘體平行或者呈一定的角度交叉排列，紡錘體的中間為染色體(圖1i)．進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅱ后期，著絲粒微管將染色體拉向兩極，形成2套姊妹染色體組，在姊妹染色體組之間存在極絲微管，而非姊妹染色體組之間沒(méi)有微管(圖1j)，隨后，極絲微管逐漸消失，微管集中在4套染色體組表面向四周呈輻射狀分布(圖1k)．隨著發(fā)育的繼續(xù)進(jìn)行，非姊妹染色體組之間也形成微管，支持4個(gè)細(xì)胞核呈特定空間分布(圖1l)．進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅱ末期，形成4個(gè)子核，每2個(gè)子核之間均有平行的微管絲相連(圖1m)．胞質(zhì)分裂是從細(xì)胞核之間的質(zhì)膜向內(nèi)縊縮開(kāi)始(圖1n)．隨著發(fā)育，縊縮繼續(xù)進(jìn)行，連接細(xì)胞核之間的微管逐漸減少(圖1o)．最后，4個(gè)細(xì)胞核被新形成的細(xì)胞壁完全隔離，構(gòu)成四分體，在四分體小孢子中的微管由細(xì)胞核表面向細(xì)胞四周呈輻射狀分布(圖1p)．

所有圖片標(biāo)尺=5 μm a:辣椒小孢子母細(xì)胞被一層厚厚的胼胝質(zhì)壁包裹；b:小孢子母細(xì)胞中的微管骨架的分布；c:小孢子母細(xì)胞中的微管呈籠形；d:小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂I中期形成紡錘體微管；e:小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂I后期，著絲粒微管縮短并集中在兩極呈帽形, 兩極之間存在一些極絲微管；f:細(xì)胞兩極之間的極絲微管進(jìn)一步增加；g:小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂I末期，微管由兩個(gè)核表面往四周輻射分布；h:微管主要集中在兩個(gè)核表面；i:小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂II中期，微管形成兩個(gè)紡錘體；j:小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂II后期，兩個(gè)紡錘體微管縮短，將染色體拉向兩極，姊妹染色體組之間有一些極絲微管，非姊妹染色體組之間沒(méi)有微管；k:微管集中在4套染色體組表面向四周輻射分布；l:非姊妹染色體組之間也形成微管，支持4個(gè)特定空間分布的細(xì)胞核；m:小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂II末期，形成4個(gè)細(xì)胞核，核之間均形成平行的微管束；n:細(xì)胞核之間的質(zhì)膜開(kāi)始向心縊縮，細(xì)胞核之間的微管束減少；o:細(xì)胞質(zhì)進(jìn)一步縊縮，細(xì)胞核之間的微管束也進(jìn)一步減少；p:胞質(zhì)分裂完成后形成的四分體，在四分體小孢子中的微管由細(xì)胞核表面向細(xì)胞四周呈輻射狀分布．圖1 辣椒小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程

3 討論

在細(xì)胞分裂過(guò)程中，處于解聚和聚合動(dòng)態(tài)變化中的微管骨架與染色體運(yùn)動(dòng)、胞質(zhì)分裂和細(xì)胞壁形成密切相關(guān)．根據(jù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中胞質(zhì)分裂的次數(shù)，高等植物的減數(shù)分裂可分為同時(shí)型和連續(xù)型2種類型．多數(shù)單子葉植物的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂為連續(xù)型，第一次分裂即產(chǎn)生新壁，形成二分體．有關(guān)玉米[17]、水稻[12]等單子葉植物減數(shù)分裂過(guò)程中微管骨架的研究表明，減數(shù)分裂細(xì)胞中主要存在3種微管類型：即減數(shù)分裂前期的核周胞質(zhì)微管，中期的紡錘體微管和后期的成膜體微管．不同的微管構(gòu)型在細(xì)胞中的功能不同：前期呈網(wǎng)絡(luò)狀的核周胞質(zhì)微管參與了細(xì)胞核的定位及向細(xì)胞表面的物質(zhì)運(yùn)輸作用；中期的紡錘體微管主要是細(xì)胞分裂時(shí)將染色體拉向兩極；成膜體微管在胞質(zhì)分裂時(shí)定位細(xì)胞板的位置．Shamina等[15]進(jìn)一步研究了單子葉植物減數(shù)分裂I末期成膜體的形成過(guò)程，發(fā)現(xiàn)在減數(shù)分裂I末期，組成紡錘體的中部微管和一些新形成的微管向赤道板集中形成了成膜體，構(gòu)成了連續(xù)型四分體的胞質(zhì)分裂基礎(chǔ)，產(chǎn)生了二分體．然而，多數(shù)雙子葉植物為同時(shí)型，第一次分裂不產(chǎn)生新壁，無(wú)二分體階段，直到第二次分裂末期，形成4個(gè)子核后才同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞壁．Traas等[18]在有關(guān)胞質(zhì)分裂同時(shí)型植物的研究中觀察到，在中期Ⅰ之后沒(méi)有形成成膜體，因此末期Ⅰ未形成二分體，而在末期Ⅱ后同時(shí)形成了四分孢子．在本實(shí)驗(yàn)中，作者觀察到辣椒小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中出現(xiàn)了前期的核周胞質(zhì)微管和中期的紡錘體微管．辣椒小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂為同時(shí)型，在其減數(shù)分裂I后期紡錘體微管沒(méi)有形成成膜體，不發(fā)生胞質(zhì)分裂，沒(méi)有二分體的形成．減數(shù)分裂II后期紡錘體微管也沒(méi)有形成成膜體，到減數(shù)分裂快要結(jié)束時(shí)才通過(guò)細(xì)胞縊縮方式進(jìn)行胞質(zhì)分裂．由此可看出，一方面，高等植物小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂中同時(shí)型和連續(xù)性差異的關(guān)鍵是成膜體的形成與否．另一方面，動(dòng)物細(xì)胞的胞質(zhì)分裂是通過(guò)細(xì)胞縊縮方式進(jìn)行的，該過(guò)程只有在微管和微絲骨架的協(xié)調(diào)作用下才能正常完成，其中微管骨架可能參與分裂溝的定位和分裂溝內(nèi)縮的起始, 而微絲骨架則主要負(fù)責(zé)分裂溝的內(nèi)縮[19]．高等植物同時(shí)型小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂中的胞質(zhì)分裂是否像動(dòng)物細(xì)胞分裂中由微絲與微管共同調(diào)控，還有待進(jìn)一步的研究．

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