辛 亮 吳雄志 謝廣茹

據(jù)我國衛(wèi)生部統(tǒng)計資料，2004—2005年我國肝癌年死亡率約為26.06/10萬，居癌癥中的第2位[1]。我國原發(fā)性肝癌90%以上為肝細(xì)胞肝癌（HCC）。目前臨床常用的治療方法為手術(shù)、化療及微創(chuàng)治療等，但有許多患者因體質(zhì)虛弱和病期較晚，無法接受上述治療，因此尋求有效而又低毒性的藥物用于治療肝癌有重要的臨床意義。守宮又稱壁虎、天龍等，為壁虎科動物多疣壁虎（Gekko swinhonis Guenther）的干燥全體。筆者已成功地分離提取出了守宮中的抗癌化合物守宮硫酸多糖（Gepsin）[2]，來源于守宮的水煮醇沉物。本研究旨在觀察由守宮中提取的Gepsin對肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞增殖和分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細(xì)胞系SMMC-7721（天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院免疫室）；人轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（晶美生物工程有限公司Human FHK 0029 TGF-β1）；人血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）ELISA 試劑盒（晶美生物工程有限公司）；蘇拉明（Suramin，Sigma）；常溫離心機（Heraeus）；低溫高速離心機（Heraeus sepatech）；酶標(biāo)儀（Labsystem Multiscann MS）；照相設(shè)備（BioRAD和Polaroid）。

1.2 方法

1.2.1 SMMC-7721細(xì)胞增殖與活細(xì)胞率測定 SMMC-7721細(xì)胞以1×104/mL密度接種于24孔板中，接種后24 h加藥培養(yǎng)，分設(shè)Gepsin高劑量組（Gepsin 100 mg/L）、Gepsin低劑量組（Gepsin 10 mg/L）與陰性對照組（加等體積1640+10%FBS培養(yǎng)液）共3組，每組5孔。加藥后30 min，24、48、72、96、120、144 h分別收集細(xì)胞，利用臺盼蘭染色，光學(xué)正置顯微鏡下計數(shù)死細(xì)胞與活細(xì)胞，做生長曲線，并計算活細(xì)胞率，活細(xì)胞率（%）=未著色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)上清中甲胎蛋白（AFP）與白蛋白（ALB）檢測 將已進入對數(shù)生長期的生長旺盛的SMMC-7721細(xì)胞消化后，離心，顯微鏡下計數(shù)，以1×104/mL密度接種于24孔板中，共分3組，即Gepsin高劑量組、Gepsin低劑量組與對照組；每組5孔，接種后24 h加藥，加藥培養(yǎng)7 d后收集上清。以聯(lián)合放免法測定AFP，溴鉀酚綠法測定ALB。

1.2.3 光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變 于24孔板中接種SMMC-7721細(xì)胞，共分3組，即Gepsin高劑量組、Gepsin低劑量組與對照組（劑量同前），光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變。

1.2.4 ELISA法檢測上清液中TGF-β1、VEGF的水平 鏡下觀察培養(yǎng)瓶內(nèi)的SMMC-7721細(xì)胞生長旺盛，進入對數(shù)生長期后，將細(xì)胞消化、稀釋、計數(shù)，并以5×104/mL的濃度將細(xì)胞接種入6孔板中，共分5組，即Gepsin高劑量組、Gepsin低劑量組、對照組，Suramin低劑量組（0.25 mg/L）和Suramin高劑量組（2.5 mg/L），每組5孔，加藥培養(yǎng)4 d后收集上清，上清液中TGF-β1、VEGF的水平以ELISA法檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計分析，計量資料采用±s表示，各組均數(shù)間的比較采用方差分析，進一步比較采用LSD檢驗；重復(fù)測量計量資料采用重復(fù)測量方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Gepsin影響SMMC-7721細(xì)胞增殖的生長曲線 不同時間之間細(xì)胞增殖的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，不同分組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，時間與分組之間存在交互效應(yīng)（均P<0.001），見表1。72 h時，低劑量組、高劑量組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；120、144 h時3組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。生長曲線顯示Gepsin對SMMC-7721細(xì)胞增殖有抑制作用，Gepsin高劑量組和Gepsin低劑量組的SMMC-7721細(xì)胞增殖明顯受到了抑制。

表1 Gepsin影響SMMC-7721增殖的細(xì)胞數(shù)變化（n=5，104/mL，±s）

表1 Gepsin影響SMMC-7721增殖的細(xì)胞數(shù)變化（n=5，104/mL，±s）

F時間=491.30，F(xiàn)交互=86.74，F(xiàn)分組=243.55，均 P<0.001

組別對照組低劑量組高劑量組30 min 1.58±0.14 1.33±0.14 1.50±0.25 24 h 1.75±0.25 1.75±0.43 1.58±0.29 48 h 2.58±0.14 2.00±0.43 2.50±1.30 72 h 3.50±0.25 2.25±0.25 2.08±0.38組別對照組低劑量組高劑量組96 h 4.33±0.63 3.75±0.43 3.67±0.38 120 h 8.17±0.88 6.58±0.38 5.00±0.25 144 h 25.25±1.25 10.75±0.90 7.75±1.15

表2 不同時間細(xì)胞計數(shù)重復(fù)測量方差分析組間比較P值

2.2 Gepsin影響SMMC-7721細(xì)胞活率的曲線 對照組、Gepsin高劑量組和Gepsin低劑量組的細(xì)胞活率采用重復(fù)測量的方差分析進行比較，F(xiàn)時間=1.418，F(xiàn)交互=1.035，F(xiàn)分組=1.327，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均 P>0.05），且細(xì)胞活率較高，均在90%以上，見圖1。

2.3 Gepsin對SMMC-7721細(xì)胞分泌上清中ALB和AFP的影響 Gepsin低劑量組、Gepsin高劑量組ALB均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Gepsin低劑量組、Gepsin高劑量組AFP低于對照組，高劑量組的分泌量低于低劑量組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3 Gepsin對SMMC-7721細(xì)胞分泌上清中ALB和AFP的影響 （±s）

表3 Gepsin對SMMC-7721細(xì)胞分泌上清中ALB和AFP的影響 （±s）

*P<0.05，**P<0.01

組別對照組（1）低劑量組（2）高劑量組（3）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）n5 5 5 ALB（mg/107）33.94±6.37 49.59±4.11 62.59±14.29 11.37*0.017<0.001 0.070 AFP（ng/106）663.08±82.83 496.87±90.69 369.06±63.06 17.10**0.006<0.001 0.026

2.4 光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變 對照組SMMC-7721光鏡下正常形態(tài)為圓形，加入Gepsin后細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯變化，變?yōu)榧忓N形。對照組的SMMC-7721細(xì)胞增殖活躍，排列緊密；加藥后細(xì)胞分散排列，變化明顯。

2.5 ELISA法檢測培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子TGF-β1、VEGF的分泌量變化 （1）TGF-β1：對照組低于Gepsin高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），Gepsin低劑量組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。Suramin高劑量組低于Gepsin低劑量組和Gepsin高劑量組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。（2）VEGF：對照組與Gepsin高劑量組和Gepsin低劑量組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。Suramin低劑量組高于Gepsin低劑量組和Gepsin高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。Suramin高劑量組與Gepsin低劑量組和Gepsin高劑量組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表4。

3 討論

守宮硫酸多糖是由中藥守宮中分離出的抗癌化合物。硫酸多糖（sulfate polysaccharide）是指糖羥基上帶有硫酸根的多糖，是抗病毒多糖中研究最多的一類[3]，天然硫酸多糖最先發(fā)現(xiàn)于軟骨素以及從豬腸黏膜中提取的肝素，后來發(fā)現(xiàn)還廣泛存在于海藻類植物。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)硫酸多糖具有顯著的抗凝血、抗腫瘤、抗病毒等活性，還是一種雙歧因子[4]，能有效增強機體免疫能力。海帶硫酸多糖（laminaria polysaccharide sulfate，LPS）是一種含有多種單糖和硫酸基的水溶性雜多糖，其生物學(xué)功能主要集中在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、血脂及血糖調(diào)節(jié)等方面。硫酸多糖可通過與生長因子和黏附因子結(jié)合來抑制類肝素酶，分離出硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的乙酰肝素鏈，通過乙酰肝素鏈引起生長因子的釋放[5]。一些硫酸多糖可以引起瘤細(xì)胞的分化和凋亡，但是機制不明。另外，硫酸多糖可增強機體對瘤細(xì)胞的先天性和適應(yīng)性的免疫應(yīng)答[6]。研究證實來自角叉菜的不同分子質(zhì)量的λ-角叉藻聚糖在體內(nèi)有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性[7]。

表4 ELISA法檢測培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的分泌量變化比較 （n=5，mg/L，±s）

表4 ELISA法檢測培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的分泌量變化比較 （n=5，mg/L，±s）

*P<0.05，**P<0.01

組別Suramin低劑量組（1）Suramin高劑量組（2）對照組（3）Gepsin低劑量組（4）Gepsin高劑量組（5）F P（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（4）（2）∶（5）（3）∶（4）（3）∶（5）TGF-β1 195.00±12.39 114.73±41.92 125.89±36.25 194.14±51.97 245.26±56.84 4.81*0.981 0.181 0.046 0.004 0.079 0.007 VEGF 425.92±9.12 481.05±3.95 238.72±1.32 216.32±13.52 308.78±13.54 431.21**0.001 0.005 0.004 0.010 0.658 0.110

本研究顯示，Gepsin可明顯抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞的增殖，但對細(xì)胞活率影響不大，原因可能是Gepsin通過影響細(xì)胞的分化和增殖來發(fā)揮抗癌劑的作用。對于形態(tài)的影響方面，SMMC-7721細(xì)胞正常特征在光鏡下為圓形，但加Gepsin后細(xì)胞變?yōu)榧忓N形。Chedid等[8]曾報道肝癌細(xì)胞表現(xiàn)為多角形和紡錘形2種形狀，并且紡錘形細(xì)胞預(yù)后較好。Gepsin對肝癌細(xì)胞的2種特異性蛋白ALB和AFP都產(chǎn)生了明顯影響，即可使肝癌細(xì)胞的某些指標(biāo)向成熟肝細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。Gepsin高劑量組的TGF-β1明顯升高，提示Gepsin可能通過上調(diào)TGF-β1的表達來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系SMMC-7721的分化。Gepsin作為一種中藥抗癌劑可使SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制、細(xì)胞形態(tài)向更好的方面發(fā)生改變，以及其加藥組培養(yǎng)上清中的AFP及ALB的明顯差異，均可說明Gepsin的確可抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生分化。TGF-β1本身是抑制腫瘤細(xì)胞增殖的，本藥處理組使肝癌SMMC-7721細(xì)胞分泌的TGF-β1水平明顯增高，從一方面說明了Gepsin可通過升高TGF-β1水平來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的分化的同時，TGF-β1本身具有的抑癌作用是否通過某種機制得到了恢復(fù)，這還有待于進一步的研究加以證實。由實驗結(jié)果可以看出，Gepsin對SMMC-7721細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用與VEGF的表達水平無關(guān)，分析原因可能是該藥不是通過抑制腫瘤細(xì)胞的血管生成而使其分化，從而實現(xiàn)其抗癌作用。

總之，經(jīng)多次實驗證實，作為肝癌的分化誘導(dǎo)劑，Gepsin是有效的。Gepsin可明顯抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖，誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞分化。其機制可能是通過上調(diào)TGF-β1來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化實現(xiàn)的。守宮作為中藥抗癌藥早在幾百年前即開始應(yīng)用，守宮硫酸多糖是從守宮中分離出的抗癌化合物，其誘導(dǎo)分化的影響機制還有待于進一步的研究。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部.2009年中國衛(wèi)生統(tǒng)計提要.2009[EB/OL].[2009-05-20]http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohbgt/s8274/200905/40765.htm

[2]Wu X,Chen D,Xie GR.Effects of Gekko sulfated polysaccharide on the proliferation and differentiation of hepatic cancer cell line[J].Cell Biol Int，2006，30(8):659-664.

[3]Lee SG,Brown JM,Rogers CJ,et al.End-functionalized glycopolymers as mimetics of chondroitin sulfate proteoglycans[J].Chem Sci，2010，1(3):322-325.

[4]岳真,曲愛琴,李守玲,等.海帶硫酸多糖的分離純化及性質(zhì)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(16)：8440-8441.

[5]Cumashi A,Ushakova NA,Preobrazhenskaya ME,et al.A comparative study of the anti-inflammatory,anticoagulant,antiangiogenic,and antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds[J].Glycobiology,2007,17(5):541-552.

[6]Wu X,Chen D.Effects of sulfated polysaccharides on tumor biology[J].West Indian Med J,2006,55(4):270-273.

[7]Zhou G,Sheng W,Yao W,et al.Effect of low molecular lambda-carrageenan from Chondrus ocellatus on antitumor H-22 activity of 5-Fu[J].Pharmacol Res，2006，53(2):129-134.

[8]Chedid A,Ryan LM,Dayal Y,et al.Morphology and other prognostic factors of hepatocellular carcinoma[J].Arch Pathol Lab Med，1999,123(6):524-528.