鄭 紡 崔 壯 王寶利 王洪武

核結合因子a1（core binding factor a1，Cbfa1）是成骨特異性轉錄激活因子，在成骨細胞發(fā)育、分化和骨形成過程中起著至關重要的分子開關作用。鑒于Cbfa1在骨形成過程中的關鍵作用，因此構建Cbfa1基因啟動子報告載體，通過觀察藥物對該啟動子轉錄活性的影響，可以用于促骨形成藥物的篩查及評價。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 小鼠成骨細胞系MC3T3E1、大腸桿菌菌種DH5α為本室保存。質粒表達載體PGL3-Basic、螢光素酶活性測定試劑盒（Luciferase assay system）、β-半乳糖苷酶活性測定試劑盒（β-galactosidase assay kit）和MluI、XhoI限制性內切酶均為Promega公司產品；質粒小量提取試劑盒和DNA提取試劑盒均購自索萊寶公司；Lipofectamine2000為Invitrogen公司產品；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶均購自GIBCO公司；dNTPs、KOD-plus ver2高保真DNA聚合酶為日本TOYOBO公司產品；T4DNA連接酶、DNA Marker為大連TaKaRa公司產品。引物序列及DNA序列分析由上海英駿生物技術公司合成及測序。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增小鼠Cbfa1基因啟動子區(qū)的DNA序列 取正常Balb/c小鼠尾靜脈血5 mL，按照DNA提取試劑盒說明書進行操作，提取基因組DNA。分析小鼠Cbfa1基因的DNA序列，巢式PCR擴增Cbfa1啟動子區(qū)-1 000 bp～+200 bp區(qū)域的片段。巢式PCR第1輪引物為Cbfa1-out-up：5′-TGCAGAAC TGCACCCAAAGTCCT-3 ′；Cbfa1-out-down：5′-GGCTGTTTG ACGCCATAGTCCCT-3′，擴增片段長度約為1 560 bp。接著以第1輪PCR凝膠純化回收后產物為模板，以Cbfa1-in-XhoI-up：5′-AAAACTCGAGTTAAGATCTTCAAAGTAACCA-3 ′ 和Cbfa1-in-MluI-down：5′-AAAAACGCGTCGGAGTGAGCAAA TATTTGAAGGACCTACTA-3′為引物進行第2輪PCR，擴增Cbfa1啟動子-1 000 bp～+200 bp區(qū)域并引入XhoI和MluI酶切位點，凝膠純化回收第2輪PCR產物。兩輪PCR反應條件均為：95 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)；72℃終延伸5 min。

1.2.2 小鼠Cbfa1基因啟動子報告載體的構建 XhoI和MluI雙酶切PCR擴增并純化回收的長約1 200 bpCbfa1啟動子DNA片段，同時將螢光素酶報告基因載體pGL3-Basic行XhoI和MluI雙酶切，回收線性化載體。T4連接酶將兩者定向連接。XhoI和MluI雙酶切并測序鑒定陽性克隆，正確插入的克隆命名為pGL3-Cbfa1報告基因載體。

1.2.3 MC3T3-E1細胞轉染與報告基因分析 使用含10%FBS、100 U/mL青霉素、0.1 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基將MC3T3-E1細胞培養(yǎng)至對數生長期后，用消化液處理細胞，換用含10%FBS無抗生素的DMEM培養(yǎng)基懸浮細胞，按2×105/孔接種至24孔板并隨機分為pGL3-Cbfa1轉染組和pGL3-Basic轉染組，使用lipofectamineTM2000分別將1 μg的重組質粒pGL3-Cbfa1和對照載體pGL3-Basic瞬時轉染至各組MC3T3-E1細胞內，每組設6個復孔，每孔均同時轉染0.1 μg β-半乳糖苷酶質粒作為內參照以校正細胞的轉染效率。轉染48 h后收集細胞，加入冰預冷的細胞裂解液（0.1 mol/L KH2PO4，1 mmol/L二硫蘇糖醇，pH=7.8），液氮凍融3次，4 ℃12 000 r/min離心20 min，收集上清。使用Luciferase assay system測定細胞的螢光素酶活性。相對熒光強度單位由β-galactosidase assay kit測定β-半乳糖苷酶活性做標準參照。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數據處理。兩組細胞同時檢測，每組細胞重復檢測3次，取平均值作為該組細胞的螢光素酶活性或β半乳糖苷酶活性值。以細胞螢光素酶活性/β-半乳糖苷酶活性比值表示啟動子螢光素酶的相對活性。pGL3-Cbfa1報告載體的活性采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠Cbfa1基因啟動子區(qū)的擴增 巢式PCR第1輪擴增片段長度約為1 560 bp，巢式PCR第2輪擴增片段長度約為1 220 bp。見圖1。

2.2 pGL3-Cbfa1重組螢光素酶報告基因載體的酶切鑒定和DNA序列分析 pGL3-Cbfa1重組螢光素酶報告基因載體經MluI和XhoI雙酶切鑒定，得到4 800 bp和1 200 bp兩條片段；pGL3-Basic經MluI和XhoI雙酶切鑒定得到約4 800 bp的線性片段。經序列測定分析，重組報告載體中插入序列完全正確，載體序列與Cbfa1基因啟動子序列正確拼接，見圖2。

2.3 pGL3-Cbfa1重組螢光素酶報告載體的活性檢測 重組報告載體pGL3-Cbfa1螢光素酶活性明顯升高（t=19.795，P<0.001），約為pGL3-Basic的35倍，見圖3。

3 討論

骨質疏松的發(fā)生主要是由于成骨細胞的作用弱于破骨細胞的作用引起的，因此要想從根本上達到治療骨質疏松的目的，增強成骨細胞活性、促進骨形成就顯得更為重要。然而目前用于臨床的藥物基本上只能抑制骨丟失，不能促進骨形成，只能在一定程度上延緩疾病的進展，卻不能逆轉業(yè)已出現的骨量減少和骨顯微結構的破壞，也就無法治愈骨質疏松。因此要想從根本上治療骨質疏松，尋找能夠增強成骨細胞活性、促進骨形成的藥物至關重要。

Cbfa1是對成骨細胞分化、成熟起關鍵作用的轉錄因子。研究發(fā)現，成骨細胞譜系高表達Cbfa1，該基因能促進成骨細胞表達骨鈣素、堿性磷酸酶、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原蛋白等下游成骨細胞表征分子，誘導多潛能間充質干細胞向成骨細胞表型分化，促進骨小結形成[1-3]。Cbfa1基因敲除的雜合子小鼠出生時骨組織發(fā)育明顯受阻，而純合子小鼠出生時無成骨細胞和骨組織形成[4]。研究還發(fā)現，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）等局部因子可上調Cbfa1表達[5-6]。因此，包括BMP在內的許多局部因子與轉錄因子Cbfa1的相互作用在成骨細胞發(fā)育和骨形成過程中起著十分重要的作用?；贑bfa1在骨形成過程中發(fā)揮的關鍵作用，筆者認為它可以作為分子靶點用于抗骨質疏松藥物的篩選。

為此，本研究進行了Cbfa1啟動子重組報告基因載體的構建，并檢測了該報告載體的轉錄活性。用于構建報告載體的小鼠Cbfa1基因啟動子序列來自基因組DNA的PCR擴增產物，考慮到如果直接擴增這段長約1 200 bp的區(qū)域，若恰好在啟動子序列的關鍵元件發(fā)生堿基錯配，會大大降低所構建載體的可信度。另外，直接將該片段與螢光素酶報告載體進行連接也不容易操作。因此，筆者采取了巢式PCR策略，通過兩輪PCR反應，使用兩套引物擴增特異性的Cbfa1基因啟動子DNA片段。文中第2對引物的功能是特異擴增位于首輪PCR產物內的一段DNA片段，并分別在兩條引物中引入能夠將Cbfa1啟動子定向克隆入螢光素酶報告載體pGL3-Basic的MluI和XhoI酶切位點。DNA序列分析結果證實整段序列全長無錯配堿基，且拼接的位置和方向正確。接下來，筆者將Cbfa1基因啟動子片段插入不含啟動子的pGL3-Basic載體的多克隆位點，獲得了重組報告基因載體pGL3-Cbfa1。該載體中Cbfa1啟動子序列中含有許多重要的順式作用元件[7]，將它瞬時或穩(wěn)定轉染細胞后，可通過檢測螢光素酶的表達水平來了解Cbfa1基因的基礎表達和藥物對Cbfa1基因啟動子轉錄活性的影響。研究中，經轉染小鼠成骨細胞系MC3T3-E1，報告基因分析研究發(fā)現pGL3-Cbfa1報告載體與對照載體相比顯示出較高的活性，約為pGL3-Basic的35倍，該結果表明所構建的報告載體能夠反映Cbfa1啟動子的活性。本文中pGL3-Cbfa1報告載體的成功構建為借助于Cbfa1啟動子進行抗骨質疏松藥物篩選提供了一個非常好的研究工具，也為進一步建立抗骨質疏松藥物的效果評價方法奠定了基礎。

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