劉曉蕾 ，張 艷，禮 海

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽(yáng) 110032）

慢性心力衰竭（CHF）是指在靜脈回流正常的情況下，由于心臟泵血功能發(fā)生障礙，心排血量減少，并導(dǎo)致組織灌注減少，肺循環(huán)和（或）體循環(huán)淤血的一組病理生理綜合征[1]。新近研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成與降解的失衡與心力衰竭發(fā)生密切相關(guān)[2]。而細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的平衡又取決于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMps）及其組織抑制因子（TIMps）的平衡[3]。益氣活血復(fù)方是臨床治療慢性心力衰竭的經(jīng)驗(yàn)方，用于防治慢性心力衰竭已取得較好的療效[4]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察益氣活血復(fù)方對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）和基質(zhì)金屬蛋白酶特異性抑制物-1（TIMP-1）的影響。從基因和蛋白表達(dá)兩方面，探討該方對(duì)慢性心力衰竭的療效機(jī)制和作用靶點(diǎn)，為中醫(yī)藥防治慢性心力衰竭提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇普通級(jí)10～12周齡健康SD大鼠60只，全部為雄性，體質(zhì)量為200～230 g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物及試劑 益氣活血復(fù)方：由黃芪、人參、紅花、丹參、益母草、三七粉、葶藶子等組成，由本溪第三制藥廠嚴(yán)格按其標(biāo)準(zhǔn)而成，處方中的全部藥材均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版有關(guān)規(guī)定。對(duì)照藥賴諾普利片：由上海信誼萬(wàn)象藥業(yè)股份提供，每片 10 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字：H10960265。MMP-1，TIMP-1 PCR試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司，試劑批號(hào)：（PRRS200707）。

1.3 主要儀器與器械 SONO S5500彩色多普勒超聲機(jī)，由Agilnet公司生產(chǎn)；2583-I型內(nèi)切式組織勻漿機(jī),由浙江機(jī)械廠生產(chǎn)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7500型，美國(guó)Bioneer公司生產(chǎn)；AO石蠟切片機(jī)，由Scientifie instruments生產(chǎn)；MS-2000多媒體化生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)，由廣州市龍飛達(dá)科技有限公司生產(chǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 心力衰竭大鼠模型的制備 大鼠經(jīng)10%水合氯醛0.005 mL/g腹腔麻醉后，背位固定，經(jīng)喉氣管插管術(shù)連接小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行人工呼吸，頻率每分鐘50次，潮氣量0.7～0.8 mL，胸部備皮，用針形電極刺入四肢及胸壁皮下與心電圖機(jī)相連，描記正常心電圖，消毒后在左側(cè)第3、4肋間橫向切開(kāi)皮膚長(zhǎng)約1.5 cm，鈍性分離軟組織，可見(jiàn)胸骨及肋軟骨，并沿3、4肋間隙打開(kāi)胸腔，用眼科小鑷子輕夾心包膜，小剪子剪開(kāi)心包膜暴露心臟，用鑷子輕提左心耳，于左冠狀動(dòng)脈前降支起源點(diǎn)2～4 mm處用6號(hào)縫線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈主干，心電示波器顯示胸前導(dǎo)聯(lián)ST段及T波顯著異常，重置心臟于胸腔，迅速分層用3號(hào)縫線縫合胸壁，并于傷口處敷以青霉素鈉，待動(dòng)物狀態(tài)平穩(wěn)后停人工呼吸。為大鼠口腔清痰，同時(shí)注射青霉素鈉每日每次20萬(wàn)單位，持續(xù)3 d防止感染。常規(guī)喂養(yǎng)1周后，第2周將其飼料減1/2量，以使其饑餓，同時(shí)每天游泳至疲乏，每日1次，共4周。經(jīng)多普勒超聲心動(dòng)圖檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)計(jì)算CI值≤180 mL/（min·kg）者為心力衰竭，列入觀察對(duì)象。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將造模成功后的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表方法隨機(jī)分為3組：模型組、中藥組、西藥組，空白對(duì)照組為未手術(shù)造模大鼠。由于在開(kāi)始造模時(shí)造模技術(shù)不成熟，部分大鼠死亡，故空白對(duì)照組、中藥組、西藥組每組8只大鼠，模型組10只大鼠?？瞻讓?duì)照組、模型組：不加任何藥物處理因素，每日1次灌服同等體積的生理鹽水；中藥組：9.2 g/（kg·d）灌胃；賴諾普利西藥組：1.5 mg/（kg·d）灌胃。前期筆者做了預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)中藥組以中劑量療效最好，因此筆者本次實(shí)驗(yàn)以中劑量給動(dòng)物用藥。均用藥6周。

2.3 各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè) 各組動(dòng)物用藥6周后，禁食不禁水12 h，在1%無(wú)戊巴比妥鈉麻醉狀態(tài)下，打開(kāi)胸腔取出心臟，取其大鼠心臟心肌組織200 mg，并于液氮中冷凍后在-80℃條件下保存，利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)和蛋白印跡分析法（Western blot）分別檢測(cè)心肌組織中MMP-1、TIMP-1基因表達(dá)和蛋白表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法，采用相對(duì)定量方法計(jì)算。用2-△△CT（Livak）方法比較經(jīng)過(guò)處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄之間的表達(dá)差異。本實(shí)驗(yàn)已對(duì)目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率進(jìn)行了比對(duì)，其效率基本一致，故本研究中采用的此相對(duì)定量法進(jìn)行。其計(jì)算公式如下：

計(jì)算 2-△△CT，其計(jì)算結(jié)果為實(shí)驗(yàn)樣本表達(dá)比正常樣本表達(dá)高出（或低出）的倍率。

應(yīng)用SPSS 18.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 益氣活血復(fù)方對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌組織MMP-1表達(dá)的影響 結(jié)果見(jiàn)表1，圖1。

表1 各組大鼠心肌組織MMP-1表達(dá)的情況（±s）Tab.1 The expression of MMP-1 in myocardial tissue of each group（±s）

表1 各組大鼠心肌組織MMP-1表達(dá)的情況（±s）Tab.1 The expression of MMP-1 in myocardial tissue of each group（±s）

注：與正常組比較，*P<0.01，#P<0.01；與模型組比較，**P<0.01，##P<0.01；與中藥組比較，△P＞0.05；▲P<0.05。

組別 n mRNA 蛋白空白對(duì)照組 81.000±0.00051.938±6.919模型組 102.671±0.838* 180.232±3.047#中藥組 81.420±0.581** 90.387±6.606##西藥組 81.555±0.432**△ 83.197±4.919##▲

圖1 MMP-1蛋白表達(dá)的Western blot顯色結(jié)果Fig.1 The result of Western blot for the protein expression of MMP-1

3.2 益氣活血復(fù)方對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌組織TIMP-1表達(dá)的影響 結(jié)果見(jiàn)表2，圖2。

表2 各組大鼠心肌組織TIMP-1表達(dá)的情況（±s）Tab.2 The expression of TIMP-1 in myocardial tissue of each group（±s）

表2 各組大鼠心肌組織TIMP-1表達(dá)的情況（±s）Tab.2 The expression of TIMP-1 in myocardial tissue of each group（±s）

注：與正常組比較，*P<0.01，#P<0.01；與模型組比較，**P<0.01，##P<0.01；與中藥組比較，△P<0.05，▲P<0.05。

組別 n mRNA 蛋白空白對(duì)照組 81.000±0.000181.455±12.688模型組 100.743±0.235* 73.543± 3.140#中藥組 81.846±0.644** 153.817±12.178##西藥組 81.518±0.460**△ 142.248±10.862##▲

圖2 TIMP-1蛋白表達(dá)的Western blot顯色結(jié)果Fig.2 The result of Western blot for the protein expression of TIMP-1

4 討論

4.1 MMP-1、TIMP-1與慢性心力衰竭的關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在模型組中，大鼠心肌組織中MMP-1的表達(dá)明顯高于其他各組，而TIMP-1的表達(dá)明顯低于其他各組。由此可見(jiàn)，模型組大鼠衰竭心肌組織存在著MMP-1和TIMP-1的失衡，因?yàn)門(mén)IMP-1表達(dá)的降低，MMP-1活性持續(xù)增高，使ECM的膠原蛋白大量降解繼而導(dǎo)致心肌重構(gòu)，促使心力衰竭的惡化。中藥組和西藥組中，MMP-1的表達(dá)較模型組明顯降低，TIMP-1的表達(dá)較模型組明顯升高，說(shuō)明中西藥治療組的治療可以降低MMP-1的表達(dá)，同時(shí)可以升高TIMP-1的表達(dá)，增強(qiáng)抑制MMP-1的作用，減少其對(duì)膠原的分解，從而達(dá)到降低MMP-1對(duì)心肌細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞作用，使MMP-1、TIMP-1的比例達(dá)到平衡。

4.2 益氣活血復(fù)方對(duì)慢性心力衰竭的影響 益氣活血復(fù)方是基于認(rèn)為氣虛血瘀為慢性心力衰竭基本病機(jī)的基礎(chǔ)上，結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)用藥，有效率達(dá)到86%以上。由人參、黃芪、丹參、三七、紅花、益母草、葶藶子等組成。諸藥配伍,具有強(qiáng)心利尿、標(biāo)本同治之功。中醫(yī)藥有調(diào)節(jié)陰陽(yáng)平衡，全面調(diào)整益氣活血的作用。本研究顯示，在中藥組中，MMP-1和TIMP-1的表達(dá)較模型組比較呈反向變化，提示益氣活血中藥對(duì)MMP-1和TIMP-1起雙向調(diào)節(jié)的作用即下調(diào)MMP-1的表達(dá)和上調(diào)TIMP-1的表達(dá)，從而使MMP-1、TIMP-1比例達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。減少M(fèi)MP-1對(duì)膠原的分解，使細(xì)胞外基質(zhì)的生成和降解達(dá)到平衡，延緩心肌重塑，增加血管的順應(yīng)性，降低心室壓力，改善心臟功能,從而阻止CHF的發(fā)展有關(guān)。與西藥組比較，除在MMP-1蛋白表達(dá)中，西藥組療效優(yōu)于中藥組，其余各組中藥組療效均優(yōu)于西藥組，揭示了益氣活血中藥作用于慢性心力衰竭的療效和作用靶點(diǎn)，為中醫(yī)藥防治慢性心力衰竭提供科學(xué)、客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]禮 海，張 艷.強(qiáng)心通脈顆粒對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌組織AngⅡ及TXB2影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2009，36（10）：1802－1804.

[2]D Armient J.Matnx metalloproteinase disruption of extracelluar matrix and cardiac dysfunction[J].Trends Cardiovasc Med,2002,12(3):97-101.

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[4]張?jiān)骑w，禮 海，張 艷.強(qiáng)心通脈顆粒治療慢性心力衰竭30例的臨床研究[J].天津中醫(yī)藥，2010，27（6）：462-464.