張?jiān)诰辏?荻，崔麗霞，馬 莉，任曉文

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.河南大學(xué)藥學(xué)院，開(kāi)封 475001；3.天津藥物研究院，天津 300193）

腦脈通軟膠囊原料提純過(guò)程中用到大孔吸附樹(shù)脂，可能帶來(lái)有害的大孔樹(shù)脂有機(jī)殘留物，參照《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄ⅤⅢP殘留溶劑測(cè)定法[1]和人用藥品注冊(cè)技術(shù)規(guī)范國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）[2]，以及國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品注冊(cè)管理對(duì)大孔樹(shù)脂的最新要求，對(duì)于在生產(chǎn)工藝中使用過(guò)大孔樹(shù)脂的原料或制劑，要對(duì)其可能帶來(lái)的正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯有機(jī)殘留溶劑進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)查閱參考文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)檢測(cè)上述殘留溶劑的方法主要是頂空進(jìn)樣法[3-9]。本實(shí)驗(yàn)就腦脈通軟膠囊中有機(jī)溶劑殘留量的測(cè)定方法進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent-6890N氣相色譜儀，頂空進(jìn)樣器：Agilent 7694E,氫火焰離子檢測(cè)器，色譜柱為DB-624石英毛細(xì)管柱（75m×0.530mm，df=3.00μm）。

1.2 試藥 正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯均為分析純，二甲基甲酰胺為分析純，水為去離子水。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為DB-624石英毛細(xì)管柱（75m×0.530 mm，df=3.00 μm），載氣為氮?dú)?，檢測(cè)器溫度為250℃，氣化室溫度為250℃，載氣流速為15mL/min，柱溫：程序升溫，起始溫度50℃維持18 min，以100℃/min的升溫速率升至80℃，再以2℃/min的升溫速率升至112℃，再以100℃/min的升溫速率升至160℃維持10 min，再以100℃/min的升溫速率升至200℃維持5 min。頂空進(jìn)樣條件：取實(shí)驗(yàn)溶液（配制方法見(jiàn)各具體項(xiàng)下）2 mL置10 mL頂空瓶中，加水2 mL，密封，搖勻（含供試品的加熱振搖使供試品溶解）。90℃平衡40 min，進(jìn)樣時(shí)間1 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取苯10.0 mg置已盛有適量二甲基甲酰胺的10 mL量瓶中，振搖溶解，以二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻；分別精密稱(chēng)取正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯各10.0 mg置已盛有適量二甲基甲酰胺的50 mL量瓶中，振搖溶解，再精密量取上述配制的苯溶液1 mL置此量瓶中，以二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液（1）。精密量取對(duì)照品溶液（1）5 mL置50 mL量瓶中，以二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液（2）。

2.2.2 供試品溶液的配制 精密稱(chēng)取本品內(nèi)容物2.00 g置10 mL頂空瓶中，精密加入二甲基甲酰胺2 mL，水2 mL，密封，置近沸水浴中加熱振搖使供試品溶解，搖勻。

2.2.3 加樣對(duì)照品溶液（回收率溶液）精密稱(chēng)取本品內(nèi)容物2 g置10 mL頂空瓶中，精密加入對(duì)照品溶液2 mL，水2 mL，密封，置近沸水浴中加熱振搖使供試品溶解，搖勻。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性與方法專(zhuān)屬性 分別取正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯和空白50%二甲基甲酰胺水溶液頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖。

經(jīng)計(jì)算各成分理論塔板數(shù)為正己烷31124、苯36688、甲苯 184390、二甲苯 229137（第 1 個(gè)峰）、苯乙烯257748、二乙烯苯679154。待測(cè)成分與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均符合規(guī)定（R≥1.5）。

2.4 最小檢測(cè)限 將對(duì)照品溶液（2）以二甲基甲酰胺稀釋?zhuān)芰咳∠♂屢? mL置已盛有本品（091120批）內(nèi)容物2.00 g的頂空瓶中，精密加入水2 mL，密封，置近沸水浴中加熱振搖使供試品溶解，搖勻。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件及頂空進(jìn)樣條件分別測(cè)定。結(jié)果各成分的最小檢測(cè)限濃度為正己烷0.2 μg/mL，苯 0.3 μg/mL，甲苯 0.3 μg/mL，二甲苯1.6 μg/mL，苯乙烯 0.8 μg/mL，二乙烯苯 2.8 μg/mL。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 分別精密量取對(duì)照品溶液（1）2、3.5、5、7.5、10 mL 置 50 mL 量瓶中，以二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻。再分別精密量取2 mL置已盛有本品（091120批）內(nèi)容物2.00 g的頂空瓶中，精密加入水2 mL，密封，置近沸水浴中加熱振搖使供試品溶解，搖勻。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件及頂空進(jìn)樣條件分別測(cè)定，扣除供試品溶液相應(yīng)成分的峰面積（見(jiàn)供試品測(cè)定項(xiàng)下），計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表1。各成分回歸方程相關(guān)系數(shù)均符合規(guī)定。

表1 回歸方程及線性范圍Tab.1 Regression equation and linear range

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液（2）與水各2 mL置10 mL頂空瓶中，密封，搖勻。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件及頂空進(jìn)樣條件測(cè)定5次，得出結(jié)果為正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為 5.6%、3.6%、3.4%、3.8%、3.2%、3.9%。

2.7 加樣回收率 精密稱(chēng)取本品內(nèi)容2.00g置10mL頂空瓶中，精密加入對(duì)照品溶液（2）2 mL，水2 mL，密封，置近沸水浴中加熱振搖使供試品溶解，搖勻。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件及頂空進(jìn)樣條件測(cè)定5次，所測(cè)峰面積扣除供試品中相應(yīng)成分的峰面積（見(jiàn)供試品測(cè)定項(xiàng)下），以精密度實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下各相應(yīng)成分平均值為對(duì)照，進(jìn)行計(jì)算，各成分回收率分別為正己烷30.8%，苯48.3%，甲苯37.3%，二甲苯27.4%，苯乙烯32.6%，二乙烯苯18.8%。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)Tab.2 The results of the average recovery%

各成分的回收率在18.8%～48.3%之間，原因是基質(zhì)的影響，為了消除其影響所以采用標(biāo)準(zhǔn)加入法（中國(guó)藥典2010版二部附錄32頁(yè)）來(lái)計(jì)算殘留物的含量。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 回收率溶液也為標(biāo)準(zhǔn)加入法的>加樣對(duì)照品溶液，所測(cè)峰面積扣除供試品中相應(yīng)成分的峰面積（見(jiàn)供試品測(cè)定項(xiàng)下）進(jìn)行計(jì)算，得出結(jié)果為正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的RSD分別為6.2%、5.9%、6.0%、5.1%、5.8%、6.4%，均符合要求。

2.9 溶液穩(wěn)定性 精密稱(chēng)取本品內(nèi)容物2.00 g置10 mL頂空瓶中，精密加入對(duì)照品溶液（2）2 mL，水2 mL，密封，置近沸水浴中加熱振搖使供試品溶解，搖勻。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件及頂空進(jìn)樣條件測(cè)定，其RSD分別為正己烷8.9%、苯3.3%、甲苯3.2%、二甲苯0.8%、苯乙烯1.9%、二乙烯苯0.5%，對(duì)照品溶液中各成分24 h之內(nèi)均穩(wěn)定。

2.10 樣品測(cè)定 按“2.7”加樣回收率測(cè)定項(xiàng)下加樣對(duì)照品溶液及“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的配制方法配制溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件及頂空進(jìn)樣條件測(cè)定，以加樣對(duì)照品溶液各成分峰面積與供試品溶液各相應(yīng)成分峰面積的差值為對(duì)照，外標(biāo)法計(jì)算，即得。結(jié)果均未檢出各殘留成分?？瞻住?duì)照品及樣品色譜圖見(jiàn)圖1-3，樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各殘留成分結(jié)果Tab.3 The results of the residual componentppm

3 討論

3.1 溶解供試品溶劑的選擇 選擇溶劑既能溶解供試品，又能溶解待測(cè)成分，對(duì)測(cè)定且無(wú)干擾。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)供試品和待測(cè)成分在單一溶劑熱二甲基亞砜、熱二甲基甲酰胺中溶解較好，但二甲基亞砜對(duì)測(cè)定有干擾，二甲基甲酰胺作溶劑待測(cè)成分檢測(cè)靈敏度較低；采用二甲基甲酰胺水混合溶媒作溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水的比例提高，檢測(cè)靈敏度隨之提高，水的比例高于50%時(shí)，樣品的溶解較差，在二甲基甲酰胺與水的比例為1∶1時(shí)，供試品既能溶解（熱水浴中），待測(cè)成分又有適宜的檢測(cè)靈敏度，且溶劑對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，因此選擇50%二甲基甲酰胺水溶液作為溶解供試品的溶劑。

3.2 水加入量對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響實(shí)驗(yàn) 分別精密稱(chēng)取供試品2.00 g置10 mL頂空瓶中，加入二甲基甲酰胺配制的對(duì)照品溶液（2）2 mL（濃度：2倍限量），分別加入不同量的水，密封，水浴加熱振搖溶解，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)二甲基甲酰胺溶液中水的加入，使待測(cè)成分檢測(cè)靈敏度提高（對(duì)沸點(diǎn)高的成分，提高較多）。

表4 水加入量對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 The results of water addition on the detection sensitivity

3.3 色譜柱的選擇 采用HP-INNOWAX（PEG20M）石英毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm，1.0 μm）為分析柱，以加樣對(duì)照品溶液為樣品，對(duì)柱溫條件進(jìn)行了篩選，結(jié)果正己烷、二甲苯始終不能與相鄰雜質(zhì)峰分離。采用DB-624石英毛細(xì)管柱（75m×0.530mm，df=3.00μm）為分析柱，以加樣對(duì)照品溶液為樣品，對(duì)柱溫條件進(jìn)行了篩選，結(jié)果在該毛細(xì)管柱條件下，待測(cè)成分與其相鄰雜質(zhì)峰均能很好分離。

3.4 柱溫的選擇 采用確定的DB-624石英毛細(xì)管柱（75 m×0.530 mm，df=3.00 μm）為分析柱，以加樣回收率項(xiàng)下加樣對(duì)照品溶液為樣品，對(duì)柱溫條件進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明在程序升溫，起始溫度60℃維持16 min，再以100℃/min的升溫速率升至150℃，維持10 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苯與其后相鄰雜質(zhì)峰不能很好分離。在起始溫度50℃維持18 min，以100℃/min的升溫速率升至80℃；再以2℃/min的升溫速率升至112℃；再以100℃/min的升溫速率升至160℃，維持10min；再以100℃/min的升溫速率升至200℃，維持5 min；載氣流速：15 mL/min。此條件下待測(cè)成分與其相鄰雜質(zhì)峰均能很好分離。

3.5 計(jì)算方法說(shuō)明 將對(duì)照品溶液加到供試品中進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果上述6種成分的回收率分別在18.8%～48.3%之間，所以采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行測(cè)定計(jì)算（將對(duì)照品溶液加到供試品中作為加樣對(duì)照品溶液，以加樣對(duì)照品溶液峰面積與供試品溶液峰面積的差值為對(duì)照，外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中殘留物的含量）。所測(cè)二甲苯為2個(gè)峰，按2峰之和計(jì)算，二乙烯苯為4個(gè)峰，按4峰之和計(jì)算（二甲苯、二乙烯苯多峰為異構(gòu)體）。

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