孫月娥，王衛(wèi)東，鄭義

1(徐州工程學(xué)院食品學(xué)院，江蘇 徐州，221111)

2(江蘇省食品生物加工工程技術(shù)研究中心，江蘇徐州，221111)

巴旦木蛋白水解物的制備及其抗氧化活性*

孫月娥1，2，王衛(wèi)東1，鄭義1

1(徐州工程學(xué)院食品學(xué)院，江蘇 徐州，221111)

2(江蘇省食品生物加工工程技術(shù)研究中心，江蘇徐州，221111)

以巴旦木蛋白為底物，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化堿性蛋白酶水解巴旦木蛋白的條件，研究巴旦木蛋白肽的還原能力、對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基以及二苯代苦味?；杂苫那宄芰Α＝Y(jié)果表明:最優(yōu)酶解工藝參數(shù)為底物濃度20%、酶濃度4%、pH值9.5、酶解溫度60℃，在此條件下巴旦木蛋白的水解度為36.6%。巴旦木蛋白肽的還原能力隨肽濃度的增大而增大，對(duì)OH·、O2－·以及DPPH·均具有良好的清除能力，清除效果隨著巴旦木蛋白肽濃度的增大而增強(qiáng)，兩者之間存在著量效關(guān)系，但當(dāng)肽達(dá)到一定濃度時(shí)，其抗氧化效果基本不受濃度影響。

堿性蛋白酶，巴旦木肽，抗氧化活性

巴旦木又名巴旦杏，是薔薇科李亞科桃屬喬木，也是新疆維吾爾人民最珍視的干果，素有“圣果”之稱。據(jù)測(cè)定，巴旦木仁內(nèi)含有蛋白質(zhì)20% ～35%、糖3% ～10%、脂肪50% ～65%、粗纖維2.5% ～3.5%，此外，還含有豐富的維生素 A1、B1、B2和 C、E、A 以及大量的微量元素［1］。食品蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶水解后不僅有助于生物體對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收［2－3］，而且水解產(chǎn)生的多肽還具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收、提高免疫力、調(diào)節(jié)神經(jīng)、降血壓、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等生理活性，有些多肽已作為天然抗氧化劑或保健食品而受到廣泛關(guān)注［4－5］。近年來，有關(guān)蛋白質(zhì)水解物抗氧化活性的研究逐漸增多，已有研究表明，抗氧化生物活性肽具有清除體內(nèi)自由基的功能，也是一種潛在的可以利用的外源性抗氧化物質(zhì)［6］。本研究以巴旦木蛋白為原料，探討堿性蛋白酶的水解條件，以及巴旦木蛋白肽的抗氧化活性、還原能力、抑制脂質(zhì)氧化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴旦木，新疆庫爾勒地區(qū);堿性蛋白酶，上海索萊寶生物科技有限公司;其他試劑均為分析純。

PC－1000數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;T756紫外可見分光光度計(jì)，上海成光儀器有限公司;LGJ－18A冷凍干燥機(jī)，常州普天儀器制造有限公司;FA－2104N電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司;80－1/2臺(tái)式離心機(jī)，常州國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 巴旦木主要化學(xué)成分的測(cè)定

水分含量:真空干燥法［7］;灰分:干法灰化法［7］;總脂肪:索氏抽提法［8］;蛋白質(zhì):微量凱氏定氮法，轉(zhuǎn)換系數(shù)為 6.25［8］;還原糖:直接滴定法［8］;總糖:苯酚-硫酸法［8］;膳食纖維:酶-重量法［9］。

1.2.2 巴旦木蛋白肽的制備工藝

巴旦木→脫脂巴旦木粕→堿提酸沉→離心→沉淀物冷凍干燥→巴旦木蛋白→酶解→滅酶(沸水浴，15 min)→離心(12 000 r/min，30 min)→上清液→濃縮→冷凍干燥→巴旦木蛋白肽

1.2.3 水解度(DH)的測(cè)定方法

在中性及堿性條件下采用 pH-stat法［10－11］，DH/%=［B×Nb×(1/α)×(1/Mp)×(1/Htot)］×100

式中:B，堿液體積，mL;Nb，堿液的當(dāng)量濃度，mol/L;α，α-氨基的解離度;Mp，底物中蛋白質(zhì)含量，g;Htot，底物蛋白質(zhì)中的肽鍵總數(shù)，mmoL/g(試驗(yàn)采用巴旦木蛋白為原料，取 Htot=7.58［12］)。

1.2.4 巴旦木蛋白肽抗氧化功能評(píng)價(jià)

還原能力測(cè)定［13］，羥自由基(OH·)清除能力的測(cè)定［13］，超氧陰離子自由基(O2－·)清除能力的測(cè)定［14］，對(duì)二苯代苦味酰基自由基的(DPPH· )清除能力的測(cè)定［15－16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴旦木的主要化學(xué)成分

由表1可見，與大部分堅(jiān)果類食物類似，巴旦木含有較多的脂肪和蛋白質(zhì)。劉金榮等［17］對(duì)巴旦木的化學(xué)成分分析顯示，脂肪和蛋白質(zhì)含量分別為58.02%和20.81，與本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果基本一致。所以除了直接食用外，也可從巴旦木中提取脂肪和蛋白質(zhì)。

表1 巴旦木的主要成分 %

2.2 堿性蛋白酶水解巴旦木蛋白的工藝參數(shù)確立

2.2.1 pH值對(duì)堿性蛋白酶水解效果的影響

取巴旦木蛋白粉1 g，在底物濃度10%，酶濃度4%，pH 值分別為 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，溫度 50℃下水解2 h，考察pH值對(duì)堿性蛋白酶水解效果的影響(圖1)。

圖1 pH值對(duì)水解效果的影響

由圖1可見，在pH值7～9內(nèi)，水解程度隨著pH值的增加而增大，當(dāng)pH值為9.0時(shí)，堿性蛋白酶的水解作用最強(qiáng)，而后隨著pH值進(jìn)一步增大，水解度呈下降趨勢(shì)，故確定堿性蛋白酶水解巴旦木蛋白的最佳pH值為9.0。

2.2.2 溫度對(duì)堿性蛋白酶水解效果的影響

取巴旦木蛋白粉1 g，在底物濃度10%，酶濃度4%，pH 9.0 條件下，分別在35℃、40、45、50、55、60℃下水解2 h，考察溫度對(duì)堿性蛋白酶水解效果的影響(圖2)。

從圖2可以看出，溫度對(duì)堿性蛋白酶水解巴旦木蛋白的效果產(chǎn)生影響。在35℃時(shí)，水解程度最低，而在55℃時(shí)堿性蛋白酶的水解作用最強(qiáng)，故后續(xù)試驗(yàn)中采用溫度為55℃進(jìn)行水解。

2.2.3 底物濃度對(duì)堿性蛋白酶水解效果的影響

圖2 溫度對(duì)水解效果的影響

取巴旦木蛋白粉1 g，分別在底物濃度3%、5%、10%、15%、20%，酶濃度4%、pH 9.0條件下水解2 h，考察底物濃度對(duì)堿性蛋白酶水解效果的影響(圖3)。

圖3 底物濃度對(duì)水解效果的影響

從圖3可以看出，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著巴旦木蛋白濃度的增加水解度不斷增加。但巴旦木蛋白濃度大于20%時(shí)水解度開始下降，故確定15%的巴旦木蛋白水解時(shí)的最佳底物濃度。

圖4 酶濃度對(duì)水解效果的影響

2.2.4 酶濃度對(duì)堿性蛋白酶水解效果的影響

取巴旦木蛋白粉1 g，分別在酶濃度2%、3%、4%、5%，底物濃度15%、pH值9.0、溫度55℃條件下水解2 h，考察酶濃度對(duì)堿性蛋白酶水解效果的影響。

由圖4可見，隨著酶濃度增加，堿性蛋白酶水解巴旦木蛋白的水解度也隨之增大，當(dāng)酶濃度4%時(shí)水解度達(dá)到最大值，故確定巴旦木蛋白水解的最佳酶濃度為4%。

2.2.5 正交試驗(yàn)確定最佳工藝參數(shù)

在前期單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上分別以pH值、酶解溫度、酶濃度、底物濃度為因素，以巴旦木蛋白水解度為指標(biāo)，采用L9(34)正交表優(yōu)化巴旦木蛋白的酶解工藝參數(shù)，正交試驗(yàn)的因素水平表及試驗(yàn)結(jié)果分別見表2和表3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表3 巴旦木蛋白酶解正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可見，影響巴旦木蛋白酶解的因素主次順序?yàn)锳＞B＞C＞D，即pH值影響最大，其次為酶解溫度、酶濃度，底物濃度的影響最小。巴旦木蛋白酶解的最佳條件為A3B3C3D2，即酶解溫度60℃、pH 9.5、酶濃度4%、底物濃度20%，在酶解最佳條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得巴旦木蛋白的水解度36.6%。

2.3 巴旦木蛋白肽的抗氧化活性

2.3.1 還原能力的比較

國(guó)外學(xué)者研究報(bào)道，抗氧化劑的抗氧化活性與其還原能力相關(guān)，吸光度值越大則樣品的還原能力越強(qiáng)［18］。以VC為參照，對(duì)不同濃度下巴旦木蛋白肽的還原能力進(jìn)行研究。由圖5可見，在濃度0.5 mg/mL之前，Vc的還原能力隨著濃度的增加而增大，此后，其還原能力有緩慢下降趨勢(shì);而巴旦木蛋白肽的還原能力一直隨著濃度的增加而增大。

2.3.2 對(duì)羥自由基(OH·)清除能力

圖5 巴旦木蛋白肽的還原能力

羥自由基(OH·)是氧的三電子還原產(chǎn)物，是最活潑的自由基，也是已知的最強(qiáng)氧化劑，比高錳酸鉀、重鉻酸鉀的氧化性還強(qiáng)。其反應(yīng)性極強(qiáng)，壽命很短，幾乎可以與所有細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)，對(duì)機(jī)體危害極大，但其作用半徑小，僅能與鄰近的分子發(fā)生反應(yīng)。

圖6 巴旦木蛋白肽對(duì)羥自由基的清除能力

圖6中比較了巴旦木蛋白肽和Vc在濃度10～50 mg/mL對(duì)羥自由基(OH·)的清除能力，由圖6可見，隨著濃度的增大，巴旦木蛋白肽和Vc對(duì)羥自由基(OH·)清除能力均增大。在濃度相同時(shí)，二者對(duì)羥自由基(OH·)清除能力無顯著性差異(P＞0.05)。一般認(rèn)為，抗氧化肽的抗氧化活性與多肽的相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸序列、氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)、金屬鹽絡(luò)合有關(guān)。巴旦木肽具有很高的羥自由基(OH·)清除能力，可能與其特殊的結(jié)構(gòu)有關(guān)，需要對(duì)其氨基酸組成及空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)試分析。

2.3.3 對(duì)超氧陰離子自由基(O2－·)的清除能力

圖7中比較了巴旦木蛋白肽和Vc在濃度10～50 mg/mL對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力。Vc對(duì)超氧陰離子自由基的清除率隨濃度的增大而增大，當(dāng)濃度達(dá)到10 mg/mL，Vc對(duì)超氧陰離子自由基的清除率基本一致，達(dá)到了99%。隨著濃度的增大，巴旦木蛋白肽對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力逐步增大，在濃度為50 mg/mL時(shí)，巴旦木蛋白肽對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到了61.90%。

圖7 巴旦木蛋白肽對(duì)超氧陰離子的清除作用

2.3.4 對(duì)二苯代苦味?；杂苫?DPPH·)的清除能力

DPPH·是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若受試物能清除它，則提示受試物具有降低羥自由基、烷自由基或者過氧自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用。在濃度10～50 mg/mL比較了巴旦木蛋白肽和Vc對(duì)二苯代苦味?；杂苫?DPPH·)的清除能力，由圖8可見，Vc對(duì)DPPH·自由基的清除率基隨濃度增大達(dá)到一定值趨于穩(wěn)定，其清除率在84.33%左右。巴旦木蛋白肽對(duì)DPPH·自由基的清除率先是隨濃度升高而增大，在20 mg/mL時(shí)達(dá)到最大，為65.73%。此后，隨著濃度的升高，其對(duì)DPPH·自由基的清除率基本保持不變。

圖8 巴旦木蛋白質(zhì)肽對(duì)DPPH·的清除作用

3 結(jié)論

Alcalase蛋白酶水解巴旦木蛋白的最佳酶解條件為:底物濃度20%、酶濃度4%、pH值9.5、酶解溫度60℃，在此條件下進(jìn)行水解試驗(yàn)，巴旦木蛋白的水解度為36.6%。巴旦木蛋白肽的還原能力隨肽濃度的增大而增大，對(duì)OH·、O2－·以及DPPH·均具有良好的清除能力，其清除效果隨著巴旦木蛋白肽濃度的增大而增強(qiáng)，兩者之間存在著量效關(guān)系，但當(dāng)肽達(dá)到一定濃度時(shí)，其抗氧化效果基本不受濃度影響。

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Study on Preparation and Antioxidant Activity of Hydrolysate from Badanmu Protein

Sun Yue-e1，2，Wang Wei-dong1，Zheng Yi1
1(College of Food Engineering，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221111，China)2(Jiangsu Engineering Research Center for Food Biology Processing，Xuzhou 221111，China)

With the badanmu protein as the substrate，the orthogonal test was taken to study the enzymatic hydrolysis condition of alcalase enzyme on badanmu proteins．The reducing power and the scavenging activity to hydroxyl，superoxide radical，and DPPH· free radicals were also investigated．The optimum hydrolysis parameters were as follows:substrate concentration 20%，enzyme concentration 4%，pH value 9．5，temperature 60℃．In this condition of hydrolysis，its hydrolysis degree for badanmu protein is 36．6% ．The reductive ability of badanmu protein peptide increased with peptide concentration increasing．The protein peptide also had good OH·，O2－·，and DPPH·scavenging activity，which increased with the concentration of peptides until its peak．The antioxidation activity of badanmu peptides were almost fixed when its concentration exceeded a certain level．

alcalase enzyme，badanmu peptides，antioxidation activity

博士，講師(E-mail:sunyuee416@yahoo.com.cn)。

*蘇北科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(BN2010005);徐州工程學(xué)院培育項(xiàng)目(XKY2009216)

2011－06－08，改回日期:2011－09－01