崔明勛，姜成哲，李太元

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

納豆中SOD的分離純化及性質(zhì)的研究

崔明勛，姜成哲，李太元

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

通過采用不同的溶液、pH和溫度處理探討了對SOD提取物活性的影響，采用硫酸銨沉淀法粗提，葡聚糖凝膠過柱，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳法判定純度。結(jié)果表明，提取時納豆搗碎與否結(jié)果沒有差異，采用緩沖液效果較好。采用50℃以上的溫度處理影響酶活性，硫酸銨飽和度在65%～90%時得到較純的酶粗提物，pH5.9的條件下有利于分離純化，得到了分子量為3.86×104u的Fe-SOD型SOD。

納豆；超氧化物歧化酶（SOD）；pH；溫度

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）廣泛存在于各種生物體內(nèi)，微生物、動物和植物都含有SOD[1]，按金屬輔基的不同分為3種類型，存在于真核生物的Cu-Zn-SOD，存在于真核生物線粒體及少數(shù)原核生物中的Mn-SOD，存在于原核生物的Fe-SOD[2]。SOD是生物體分解超氧陰離子的主要金屬酶，在防止生物體免受氧自由基損傷，提高人體免疫力，延緩機(jī)體衰老等方面起重要作用[3]，對類風(fēng)濕、關(guān)節(jié)炎等疾病的治療有顯著療效，在日用化工產(chǎn)品及食品領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛[4]。因此，需要安全可靠易生產(chǎn)的來源以滿足需求。

納豆是日本傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品之一，是將大豆用枯草芽孢桿菌或納豆菌發(fā)酵而成的[5]，具有較高的營養(yǎng)價值。在納豆激酶被發(fā)現(xiàn)以來，其作為功能性食品更為人們所關(guān)注，研究資料表明，其具有溶血栓、控制骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展[6]、抗氧化、降血壓等作用。并且也是較安全、廉價的食品。

本實驗對納豆中SOD的分離純化條件進(jìn)行了摸索，尋找最佳方案，對分離得到的SOD的一些性質(zhì)進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

納豆：由吉林省延邊草仙藥業(yè)公司提供；鄰苯三酚：上海生化試劑所；考馬斯亮藍(lán)G-250：上海綠鳥科技發(fā)展有限公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、NaCl：分析純,天津市化學(xué)試劑六廠；牛血清白蛋白：Simga公司；SDS-PAGE低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)：上海升正生物技術(shù)有限公司；葡聚糖凝膠：上?；瘜W(xué)試劑公司分裝廠。恒溫水浴鍋：北京市醫(yī)療設(shè)備廠；部分收集器、核酸蛋白檢測儀：上海青浦滬西儀器廠；722S型分光光度計：天津市普瑞斯儀器有限公司；超純水系統(tǒng)：Millipore公司；低溫冷凍離心機(jī)：Hitachi公司；筆型酸度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 納豆SOD提取方法的選擇

1.2.1.1 不同提取液及處理對納豆SOD活力的影響

取8份納豆，每份15g，分成兩組，其中一組把納豆搗碎，一組直接使用，分別加入蒸餾水、0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液、0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液、0.9%氯化鈉溶液各30 mL，在搖床上振蕩1 h，4000 r/min 離心 15 min，取上清液，進(jìn)行SOD活力和蛋白含量測定。

1.2.1.2 不同溫度對納豆SOD活力的影響

稱38 g納豆，加入76 mL蒸餾水，振蕩1 h，離心，取上清液，分成10份，1份4℃保存，剩余的分成3組，分別放入40、55和70 ℃水浴中，在10、25、40 min時各取出1份，迅速放入冰浴中冷卻，測定SOD活力和蛋白含量。

1.2.1.3 不同pH對納豆SOD活力的影響

取納豆45 g納豆，加入90 mL蒸餾水，振蕩1 h，離心，取上清液，取等量6份，用0.5 mol/L HCl溶液或0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)整納豆洗液的pH分別為4.5、5.5、7、8.5、10、11.5。置4 ℃冷藏，過夜后，4000 r/min 離心20 min，取上清液調(diào)整pH為7，記錄上清液的體積并檢測SOD活力和蛋白含量。

1.2.2 納豆SOD的純化

1.2.2.1 納豆SOD的粗提

稱取納豆，加0.05 mol/L的磷酸緩沖液洗滌，收集洗滌液，4800 r/min離心30 min，取上清液邊攪拌邊加入硫酸銨粉末，使飽和度達(dá)到65%～70%之間，4℃冷藏過夜，取出離心，收集上清液，再加入硫酸銨粉末，使飽和度達(dá)到90%，過夜，離心，取沉淀加水溶解，放入透析袋中透析24 h。

1.2.2.2 葡聚糖凝膠過柱純化

取出透析過的溶液，加入0.5 mol/L pH5.9的磷酸緩沖液，檢測溶液的pH，達(dá)到5.9后，冷藏，過夜，4000 r/min離心20 min，取上清液，用透析袋濃縮，濃縮液離心，上清液用葡聚糖凝膠G-50過柱，洗脫液用0.05 mol/L pH5.9磷酸緩沖液，經(jīng)核酸蛋白檢測儀280 nm處檢測，結(jié)合SOD活力測定，收集有活力的部分，用透析袋濃縮，濃縮液離心，上清液如上條件，再過葡聚糖凝膠G-150，活性部分濃縮后，離心，上清液冷凍保存。

1.2.2.3 電泳

首先采用7.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，判定蛋白質(zhì)分離的效果，直到出現(xiàn)一條蛋白帶，再使用15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，以SDS-PAGE低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)作基準(zhǔn)，計算SOD的分子量。

1.2.3 納豆SOD性質(zhì)

1.2.3.1 納豆SOD類型

采用氯仿-乙醇溶液和H2O2對SOD活力抑制的方法進(jìn)行SOD類型的鑒定[7]。

氯仿-乙醇（按體積比2∶3）溶液按0%、10%和40%的比例與20%的酶液混合，在25℃處理10 min，測定酶的活力，并以等量抑制劑做空白對照進(jìn)行計算。

配制20 mmol/L和10 mmol/L的過氧化氫溶液，與酶液1∶1混合，使其終濃度達(dá)到5 mmol/L和10 mmol/L，分別在25℃處理10 min和20 min，以加蒸餾水的酶液作對照，測定酶活力。

1.2.3.2 納豆SOD溫度穩(wěn)定性

從冰箱中取出酶液，取等量的酶液，分別在20、40、55、70、85℃的溫度下保溫20 min，加熱過的取出后迅速冷卻，測定酶活性。

1.2.4 SOD活力的測定

采用修正的聯(lián)苯三酚自氧化法[8]。

酶活力單位的定義：在一定條件下，在1 mL反應(yīng)液中，每分鐘抑制聯(lián)苯三酚自氧化速率達(dá)50%時的酶量為1個酶活性單位（U）。

1.2.5 蛋白含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)法。用牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

2 結(jié)果與討論

2.1 納豆SOD提取方法的選擇

2.1.1 不同提取液及處理對納豆SOD活力的影響

納豆使用不同溶液洗滌的結(jié)果（見表1），4種不同的溶液洗滌得到的酶液，方差分析結(jié)果，SOD比活力之間，用磷酸緩沖液洗滌的與用蒸餾水洗滌的之間差異極顯著，與用0.9%NaCl洗滌的之間差異顯著。用蒸餾水洗滌的活力最低。而搗碎的納豆和沒有搗碎的納豆之間，沒有顯著差異，可以認(rèn)為該酶是納豆菌分泌出來的，酶蛋白主要存在于納豆的表面。從比活力來看，用磷酸緩沖液洗滌的比活力較高。

2.1.2 不同溫度對納豆SOD活力的影響

納豆用蒸餾水洗滌的粗提液，測定SOD活力和蛋白含量的結(jié)果，放到4℃下的活力為（115.3±9.74）U/mL，蛋白含量為（0.52±0.03）mg/mL，比活力為（219.9±7.76）U/mg。40℃下分別處理10、25、40 min的結(jié)果表明與4℃下處理的沒有差異，而比活力隨著溫度的提高極顯著地降低，經(jīng)方差檢驗40℃時與55℃和70℃之間存在著極顯著差異。處理時間的延長，活力和蛋白含量都有所降低，比活力之間差異不顯著（結(jié)果見表2）。

2.1.3 不同pH對納豆SOD活力的影響

對納豆水洗液分別經(jīng)過1 mol/L HCl溶液調(diào)整為酸性，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)整為堿性，4℃過夜等待蛋白質(zhì)沉淀，取上清液，再把所有的溶液pH調(diào)為7，測定蛋白質(zhì)含量和SOD活力的結(jié)果，蛋白質(zhì)含量pH 4.5和11.5的降低較多，而pH10的含量最多，SOD活力也有類似的變化，其變化從比活力值來看，pH 4.5降低最多，然后是pH 11.5、5.5的，見表3。pH對酶活性的變化規(guī)律與Cu,Zn-SOD的變化相似[9]，而pH 6時SOD比活力略低于最高值，見圖1。

表 1 不同溶液和處理對納豆SOD活力及比活力結(jié)果（x±SD）Table 1 The results of different solution and treatment on specific activity of SOD

表 1 不同溶液和處理對納豆SOD活力及比活力結(jié)果（x±SD）Table 1 The results of different solution and treatment on specific activity of SOD

注：**表示與蒸餾水相比差異極顯著；#表示與0.9%NaCl相比差異顯著。

表 2 不同溫度和時間處理對納豆SOD活力和比活力結(jié)果Table 2 The results of different temperature and time treatment on specific activity of SOD

表 2 不同溫度和時間處理對納豆SOD活力和比活力結(jié)果Table 2 The results of different temperature and time treatment on specific activity of SOD

表 3 不同pH處理對納豆SOD活力的結(jié)果Table 3 The results of different pH treatment on specific activity of SOD

表 3 不同pH處理對納豆SOD活力的結(jié)果Table 3 The results of different pH treatment on specific activity of SOD

pH 4.55.578.51011.5蛋白濃度/（mg/mL）3.1±0.13.34±0.23.33±0.153.48±0.063.65±0.252.9±0.03活力/（U/mL）229.68±31.89586.46±38.91734.58±20.1797.9±53.53806.82±40.86381.34±40.8比活力/（U/mg）73.84±7.93176.69±22.26220.85±3.61229.16±11.59221.23±4.02131.51±12.52

2.2 納豆SOD的純化結(jié)果

2.2.1 納豆SOD的粗提和過柱

稱取100 g納豆，用200 mL蒸餾水分次洗滌，洗脫液經(jīng)45%硫酸銨沉淀，出現(xiàn)大量的沉淀物，但其蛋白質(zhì)含量很低，飽和度達(dá)到70%時，沉淀中有蛋白質(zhì)出現(xiàn)，飽和度達(dá)到90%后，沉淀有DOS活性，離心后的上清液黏度降低，并變得透明。

過柱前用0.5 mol/L pH5.9的磷酸緩沖液處理，雖然對SOD活性有一定的影響，可以減少雜蛋白，特別是降低溶液的黏度，有利于過柱分離。過葡聚糖凝膠G-50的洗脫液經(jīng)過280 nm檢測時，得到的吸收峰是一個較寬的單峰，峰的前部分具有SOD活力，而后部分的吸收峰SOD活力低或無活力，收集液能夠看到白色的混濁現(xiàn)象。過葡聚糖凝膠G-150后，出現(xiàn)前后兩個峰，也沒有徹底分開，前峰有活性。經(jīng)過多次過柱，提純倍數(shù)達(dá)到22.2倍，得率為23%。

2.2.2 電泳

采用7.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳時，有活性的部分總有一條跑的最快的帶，比牛血清白蛋白跑的還快，經(jīng)多次過柱，得到一條帶，所以認(rèn)定為SOD蛋白帶。經(jīng)15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量，分子量為3.86×104u，與文獻(xiàn)[10]中所述相一致。

2.3 納豆SOD性質(zhì)

2.3.1 納豆SOD類型

提純的酶液用氯仿-乙醇溶液處理，以沒加氯仿-乙醇溶液為對照，10%的活力為對照的89%，抑制效果較低。而40%的相對活力將為44%。出現(xiàn)明顯的抑制作用，見圖2。

5 mmol/L的H2O2處理10 min時，抑制率為98%，抑制作用很低，10 mmol/L H2O2處理的10 min時已經(jīng)開始出現(xiàn)抑制作用抑制率為81%，在20 min時，兩種濃度下的抑制能力相似，為51%，見圖3，說明隨著時間的延長，H2O2出現(xiàn)抑制作用。

兩種處理對酶的活力都有抑制作用，說明酶的類型應(yīng)是Fe-SOD。

2.3.2 納豆SOD溫度穩(wěn)定性

酶液經(jīng)過不同溫度處理，活性以放在20℃的為準(zhǔn)，得到相對活力，見圖4，活性最高是40℃下保溫的，相對活性達(dá)到123%，而55℃和70℃的，活性已經(jīng)降到66%和61%，此結(jié)果與提純前的酶活力比較，放置在20℃下的酶活力比40℃處理的低，與提純前的不同，可能與提純過程及條件變化有關(guān)，其它的結(jié)果都相似。在85℃處理的，活性已下降到了41%，比文獻(xiàn)[11]中耐高溫微生物產(chǎn)的SOD在55℃和75℃時熱穩(wěn)定性較差，比起Cu，Zn-SOD熱穩(wěn)定性在55 ℃時也低[12]。因此，納豆烹飪時，應(yīng)該考慮比其它來源SOD需要較低的溫度。

3 結(jié)論

從納豆中提取SOD過程來看，最大的障礙是納豆洗液的黏度，其黏度主要是由于納豆中存在的大量γ-聚谷氨酸所造成[13]，在分離提純的每一步驟都產(chǎn)生干擾。提取條件來看，使用磷酸緩沖液有利于酶液的提取，不能采用提高溫度的方法來達(dá)到純化酶的目的，純化時采用pH5.9的緩沖液，雖然不是酶的最適pH，對酶的活性有一定的影響，但可以有效降低酶液的黏度，有利于分離提純。此SOD的類型是Fe-SOD型，分子量約為3.86×104u，并認(rèn)為是納豆菌分泌性酶。

參看文獻(xiàn)：

[1]梁春梅，袁旭，沈娟，等.正交試驗優(yōu)選淡豆豉中SOD的最佳水提條件[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，45(5)：714-716

[2]楊明琰，張曉琦，沈儉，等.微生物超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志,2004,24(1)：49-51

[3]宮莉，叢娟，王曉俊,等.酵母SOD高產(chǎn)菌的選育及發(fā)酵條件[J].長春工業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2006，27(3):204-207

[4]陳彥斌，詹現(xiàn)璞，張宏盈，等.SOD的保健作用及在乳制品中的應(yīng)用[J].中國乳業(yè),2007(5):40-44

[5]段智變，江曉，江漢湖，等.納豆提取物對實驗性高脂血癥的作用研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2002,28(12)10-13

[6]陳麗娟，沙長青，新偉，等.國外納豆激酶的開發(fā)現(xiàn)狀[J].生物技術(shù)，2003，13(3)：44

[7]劉妮娜，姚忠，葉艷華，等.耐鹽節(jié)桿菌Arthrobacter pascens DMDC12中Mn-SOD的純化及性質(zhì)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2008，27(1)：103-108

[8]龐戰(zhàn)軍，周玫，陳瑗.自由基醫(yī)學(xué)研究方法[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：110

[9]袁勤生，陳浩，姚菊芳，等.牛馬血超氧化物歧化酶的制備新工藝[J].生化藥物雜志，1991,56(2)：20-22

[10]郭中滿，茍仕金，殷禮.超氧化物歧化酶研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)科技，1991，21(4)：45-47

[11]王忠彥，黃英，胡永松.一株耐高溫SOD產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)特性[J].微生物學(xué)報，1997，37（4）：307-311

[12]袁勤生，陳浩，朱利民.Cu,Zn-SOD理化性質(zhì)的比較[J].華東化工學(xué)院學(xué)報,1992,18(3)：291-295

[13]張春嶺，郭愛玲.納豆中γ-PGA的分離純化和鑒定[J].農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊，2007,10(115):：78-83

Study on the Extracting and Purification Superoxide Dismutase（SOD）from the Natto

CUI Ming－xun，JIANG Cheng－zhe，LI Tai－yuan
（Agriculture College，Yanbian University，Yanji 133000，Jilin，China）

Through the use of different solutions，pH and temperature process of combining，tested the SOD activity.Crude SOD was extracted by the method of ammonium－sulfate precipitation，the Sephadex gel，the polyacrylamide electrophoresis to decided the purity.There was no different result purity that with or without mash，buffer solution was better.More than 50℃ deal with effects of the enzyme activity and ammonium－sulfate reveal the humidity at 65%-90%had a pure crude enzyme extraction，pH5.9 conditions conducive to the separation，purification，the molecular weight for 3.86×104u Fe-SOD type were obtained.

Natto；superoxide dismutase（SOD）；pH；temperature

延邊大學(xué)科技發(fā)展項目（2009第015號）

崔明勛（1966—），男（朝鮮），副教授，博士，主要從事藥理學(xué)和生物化學(xué)研究。

2011-06-11