李娣昕，曾紅兵，紀春陽，梁萍萍，位紅蘭

(1.成都市第五人民醫(yī)院腎內(nèi)科，611130;2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢 430030)

腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)是多種腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰竭的共同通路，是反映腎功能下降嚴重程度和判斷預(yù)后最重要的指標。因而，對其發(fā)生、發(fā)展的機制及其防治的研究有著重要的臨床意義。吡非尼酮(pirfenidone，PFD)是目前經(jīng)實驗證實的少數(shù)可延緩甚至逆轉(zhuǎn)纖維化的藥物之一。實驗證實［1-2］，PFD能夠延緩單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型大鼠TIF，但其機制尚未完全明了。筆者從腎小管上皮細胞(renal tublar epithelial cells，RTC)凋亡的角度初步探討 PFD對UUO模型大鼠TIF的作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型與分組 雌性Wistar大鼠35只［由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，許可證編號:SCSK(鄂)2004-2007，體質(zhì)量 130 ～150 g］，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分為3組:假手術(shù)組(7只)，模型組(14只)，治療組(14只)。模型組及治療組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組僅分離左側(cè)輸尿管，不結(jié)扎即關(guān)閉腹腔。各組大鼠均正常進食、飲水，治療組從手術(shù)前1 d至手術(shù)后14 d給予PFD(上海睿星基因技術(shù)有限公司提供，純度 ＞99%，250 mg·kg-1·d-1，劑量參考文獻［3］，用1%羧甲基纖維素鈉溶液制成懸液)灌胃，其他組每日灌服等容積1%羧甲基纖維素鈉溶液。

1.2 標本留取 假手術(shù)組于手術(shù)后14 d處死;模型組和治療組于手術(shù)后7及14 d各處死一半大鼠。剖腹后先取下腔靜脈血(每只約5 mL)，用于生化檢測。各組均取左側(cè)腎臟皮質(zhì)組織，取約200 mg置于-80℃冰箱保存，其余置4%多聚甲醛中固定約36 h。常規(guī)制成切片厚約4μm。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 生化分析 下腔靜脈血經(jīng)1 500 r·min-1(r=10 cm)離心5 min后取血清，采用全自動生化分析儀，檢測血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，Scr)，鉀離子(K+)和鈉離子(Na+)。

1.3.2 病理學(xué)檢測及纖維化評估 組織切片常規(guī)行過碘酸希夫染色(periodic acid-Schift stain，PAS)、Masson染色。應(yīng)用病理圖集采集和分析系統(tǒng)軟件(HMIA2000型)，在高倍鏡下每個標本隨機選取10個不含腎小球和大血管的腎皮質(zhì)視野，纖維化陽性面積占統(tǒng)計場總面積的百分比作為腎小管間質(zhì)的纖維化指數(shù)(%)，求和，取平均值。

1.3.3 腎小管上皮細胞凋亡及結(jié)果評估 應(yīng)用TUNEL堿性磷酸酶標記的原位細胞凋亡檢測試劑盒(德國羅氏)，按試劑盒說明進行操作。不加酶的標記溶液代替TUNEL反應(yīng)混合物作陰性對照，實驗室既往證實陽性結(jié)果作為陽性對照。細胞核呈棕黃色至黃褐色者為陽性細胞，應(yīng)用病理圖集采集和分析系統(tǒng)軟件，在高倍鏡下對每個標本隨機選取10個互不重疊的皮質(zhì)視野(避開腎小球及大血管)，計數(shù)腎小管上皮細胞(根據(jù)凋亡細胞所處位置及該位置已知細胞組成來區(qū)分)，以陽性細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比值作為凋亡指數(shù)(%)。

1.3.4 免疫組化測原位 半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3蛋白表達及腎小管上皮細胞陽性評估試劑均購于武漢博士德生物工程有限公司，按說明書進行操作。磷酸鹽緩沖溶液代替一抗作為陰性對照，實驗室既往證實陽性結(jié)果作為陽性對照。細胞質(zhì)呈黃褐色、細胞核藍色或參雜少許黃褐色為陽性細胞。結(jié)果評估同上。

1.3.5 組織勻漿制作、比色法測丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)MDA、SOD、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。應(yīng)用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液裂解腎組織，制成10%和1%勻漿，比色法分別測定腎組織MDA含量及總SOD活性，按試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(x±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)間的兩兩比較用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化分析 各組大鼠在BUN、Scr、K+和Na+指標上無明顯差異。

2.2 病理學(xué)改變 假手術(shù)組腎臟病理改變不明顯;模型組可見不同程度腎小管擴張或萎縮，間質(zhì)明顯趨向纖維化，以14 d時為重;治療組纖維化程度較模型組明顯減輕，詳細結(jié)果見表1。

2.3 腎小管上皮細胞凋亡改變 假手術(shù)組腎小管上皮細胞偶見凋亡;模型組則明顯增多，且凋亡指數(shù)隨病程延長增加;治療組細胞凋亡明顯減輕，與模型組比較7及14 d分別減少53.0%，58.0%，詳細結(jié)果見表1。TUNEL染色14 d結(jié)果見圖1。陽性細胞胞核呈黃色至褐色，細胞質(zhì)不著色。

表1 3組大鼠腎間質(zhì)纖維化、腎小管上皮細胞凋亡及Caspase-3表達變化Tab．1 Ratio of TIF、apoptosis of RTCs and Caspase-3-positive RTCs of rats in 3 groups %±s

表1 3組大鼠腎間質(zhì)纖維化、腎小管上皮細胞凋亡及Caspase-3表達變化Tab．1 Ratio of TIF、apoptosis of RTCs and Caspase-3-positive RTCs of rats in 3 groups %±s

與模型組比較，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01;與假手術(shù)組比較，*3 P＜0.05Compared with model group，*1 P ＜ 0.05，*2 P ＜ 0.01;Compared with sham operation group，*3 P ＜0.05

組別與時間 大鼠/只纖維化指數(shù)凋亡指數(shù)Caspase-3-陽性指數(shù)治療組14第7天 7.1±1.9*1 2.5±1.6*1 20.0±2.5*2第14天 16.2±2.0*1 3.8±2.4*1 25.0±3.5*2模型組 14第7天 10.5±2.7*3 5.3±2.0*3 30.0±2.5*3第14天 33.0±3.1*3 9.2±3.1*3 52.5±3.0*3假手術(shù)組7 2.3±0.4 0.4±0.2 8.7±2.0

2.4 腎小管上皮細胞Caspase-3表達 在假手術(shù)組，Caspase-3表達較少，模型組與之相比明顯增加，7及14 d分別增加2.4，5.0倍，而治療組分別下調(diào)33.0%，52.0%，詳細結(jié)果見表1。14 d染色結(jié)果見圖2。陽性細胞細胞質(zhì)呈黃色至褐色，細胞核可呈部分黃色至黃褐色。

圖1 3組大鼠高倍鏡下TUNEL陽性的腎小管上皮細胞(×400)①假手術(shù)組;②模型組第14天;③治療組第14天Fig．1 TUNEL-positive RTCs of rats in 3 groups under high power lens(×400)①sham operation group;②UUO model group at day 14;③treatment group at day 14

圖2 3組大鼠高倍鏡下Caspase-3陽性表達的腎小管上皮細胞(×200)①假手術(shù)組;②模型組;③治療組Fig．2 Caspase-3-positive RTCs of rats in 3 groups under high power lens(×200)①sham operation group;②UUOmodel group;③treatment group

2.5 腎皮質(zhì)MDA含量及SOD活性 與假手術(shù)組比較，模型組MDA含量明顯升高，7及14 d時分別升高2.9，0.9倍(P＜0.01);與模型組同期相比，治療組MDA含量7 d時明顯下調(diào)(P＜0.01)，但14 d時差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

與假手術(shù)組比較，模型組SOD活性降低，7及14 d分別降低46.0%，53.0%(P＜0.01);但治療組較模型組同期明顯上調(diào)，7及14 d分別上調(diào)33.0%，38.5%(P ＜0.01)。見圖3，4。

3 討論

TIF是各種腎臟病進展至終末期的共同通路，也是判斷預(yù)后的關(guān)鍵指標，延緩TIF的進展是治療腎臟疾病、改善預(yù)后有效方法。UUO模型是研究TIF的理想模型，故本實驗選擇UUO大鼠作為研究對象。

PFD是一種新型的廣譜抗纖維化藥，能夠防止甚止逆轉(zhuǎn)纖維化的發(fā)生和瘢痕形成，它耐受性好，不良反應(yīng)少見而輕微，這已經(jīng)在大量的體外和動物實驗中得到證實［1］，可望成為腎纖維化治療的新選擇［2，4］，但機制了解甚少。

TIF是一個多因子多通路共同作用的復(fù)雜過程，總體來說，包括正常結(jié)構(gòu)的破壞和異常物質(zhì)的沉積。腎小管上皮細胞占腎單位的約80%。實驗證實，其凋亡在TIF過程中起著重要的作用，它直接參與病理狀態(tài)下的腎小管萎縮、管腔擴張等變化［5］，并可通過分泌白細胞介素、趨化因子等后效應(yīng)［6-7］，作用于其他細胞，參與細胞外基質(zhì)增多過程。故認為能夠抑制TIF凋亡的藥物就極可能延緩或逆轉(zhuǎn)腎小管間質(zhì)纖維化，從而改善腎病患者腎功能及預(yù)后［8］。因此，筆者從RTC凋亡的角度，探討PFD對UUO模型TIF的影響。結(jié)果顯示UUO模型組與假手術(shù)組相比，腎小管上皮細胞凋亡顯著增多，尤其在腎小管擴張或萎縮、細胞外基質(zhì)增多的部位，證實RTC凋亡在TIF中的作用;而治療組與模型組相比，RTC凋亡明顯減少，證實PFD對UUO模型中的RTC凋亡亦有抑制作用。故推斷PFD能通過抑制RTC的凋亡從而改善UUO的TIF。

對于PFD抑制凋亡的詳細機制，可從Caspase-3和氧化應(yīng)激兩方面進行探討。一方面，Caspase是執(zhí)行細胞凋亡的主要酶類，具有蛋白酶的生物學(xué)特性，其中Caspase-3參與凋亡過程的終末期，在凋亡病理過程中起著中心作用，對UUO所致的腎小管上皮細胞凋亡同樣起著重要的作用。本實驗顯示在凋亡增多的小管，Caspase-3表達亦呈同樣趨勢增加，尤其在UUO模型組十分明顯;而在治療組，Caspase-3與RTC凋亡呈同樣趨勢下降。這不僅證實Caspase-3對RTC凋亡起著重要作用，亦說明PFD能通過抑制Caspase-3的表達從而抑制RTC的凋亡。

另一方面，UUO模型中由于手術(shù)張力應(yīng)激所致的腎血漿流量的下降(腎組織缺血、低氧)，巨噬細胞和腎小管上皮細胞活化引起炎癥反應(yīng)等，均能產(chǎn)生大量的反應(yīng)氧代謝產(chǎn)物(reactive oxygen species，ROS)，而活性氧增多是凋亡的線粒體途徑的誘因之一，提示UUO手術(shù)后氧化應(yīng)激增強與腎組織細胞凋亡密切相關(guān)，CUTTLE等［9］的實驗證實了這一點。許多學(xué)者也證實抗氧化劑 具有抗凋亡作用［10-12］。本實驗顯示，UUO模型組腎皮質(zhì)勻漿中脂質(zhì)過氧化物的標志物MDA明顯升高，提示在UUO手術(shù)后有大量的ROS產(chǎn)生;而機體最主要的抗氧化酶SOD的活性在UUO手術(shù)后明顯減少，這說明ROS的激增與機體對ROS的中和及清除減少有關(guān)。而在治療組，這兩方面均得到明顯改善。提示PFD能夠顯著改善氧化應(yīng)激，從而抑制RTC凋亡。

此外，各組大鼠的生化檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明在2周內(nèi)UUO模型大鼠的腎功能仍處于代償，且提示PFD未造成額外的生物學(xué)不良反應(yīng)。

綜上所述，PFD能夠抑制UUO所致的腎小管上皮細胞凋亡，從而延緩腎間質(zhì)纖維化，其機制可能與抑制氧化應(yīng)激所致凋亡及Caspase-3相關(guān)的途徑有關(guān)。本研究為PFD治療UUO腎間質(zhì)纖維化提供了另外一條依據(jù)。

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